破譯質粒圖譜需要掌握哪些知識點呢？

質粒是什麼顏色

質粒是基因工程中常用的載體，也是生物學實驗的基本要素，正確的閱讀質粒圖譜是實驗的第一步，對於實驗小白，本文教你如何快速破譯質粒圖譜。

首先，熟悉你所感興趣的質粒

讓我們從一個經典的質粒pBR322開始，由於它具有成功克隆所需要的所有特性，因此常被用作衍生載體的主幹。從圖譜中心可以看到，線性化質粒的大小為4361個鹼基對。在開始處理任何質粒之前，建議使用一種獨特的限制性內切酶將其線性化，以檢查大小是否與預期大致相同。

黑色箭頭表示轉錄的方向，這是克隆所必需的。如果你在另一個基因的中間克隆了你的目的基因，請確保這兩個基因的轉錄方向相同。否則，本地啟動子會干擾你的基因表達。

“Ori”是什麼意思？

在諸如Entrez-PubMed這樣的基因序列資料庫中，質粒序列以線性序列的形式從ori序列開始繪製。“Ori”指質粒複製的起點，不能改變它，一旦質粒不能複製，則是無用的。

關於ori要記住的另一件事是，同源質粒常常是不相容的。這意味著你將無法在一個細胞中維持兩個pBR323衍生的載體，即使它們具有不同的抗生素耐藥性基因。pBR322 ori也被用於pUC18，真核生物載體中第二常見的主幹。

限制性位點在哪裡找？

相應酶的限制性位點用起始核苷酸位置的垂直線表示。這些位置應該是唯一的，但值得一查，因為衍生載體通常包含額外的被遺忘的序列。

關於抗生素抗性基因

pBR322有兩種抗性基因：tet（四環素耐藥）和amp（氨苄青黴素耐藥）。這些基因分別編碼一個外排泵（tetR）和β-內醯胺酶（ampR）從細胞中排洩四環素和氨苄青黴素。Tet和amp從不同的方向閱讀。

記住，β-內醯胺酶對青黴素類抗生素的解毒沒有特異性。所以即使你有兩個不同複製起點的質粒，如果一個表達了甲氧西林耐藥基因另一個表達了氨苄青黴素抗性基因，你也不能同時選擇兩個質粒。

當使用限制性內切酶位點將目的基因克隆到質粒時，要注意哪些位點屬於你的抗生素抗性基因。例如，BamHI在TetR的中間酶切。我們都知道，基因的破壞會導致基因功能的失活——在這種情況下，就是抗生素耐藥性。

複製如何開始和停止？

質粒除了基因外，通常還包含轉錄啟動子和終止子來自E。coli噬菌體。噬菌體SP6和T7的啟動子常用於體外RNA擴增。它們需要噬菌體聚合酶，因此在體內不活躍。

下圖為爪蟾卵母細胞表達載體pTLNX的表達圖譜。除了常見的pBR322 ori和抗生素耐藥基因AmpR和CmR（氯黴素耐藥）外，還存在SP6和lacUV啟動子。在SP6啟動子下游，rrnBT2終止子允許克隆到多克隆位點的基因有效終止。

pTLNX載體還具有質粒選擇基因（ccdB），以及病毒SV40核定位訊號和Xenopus globine 3 ‘ UTR，允許克隆基因的高表達。

質粒圖譜總是在進化，最好使用已知的圖譜資源庫，如Addgene、Entrez-PubMed等，以免忽略一些“不重要”的特性，而這些特性對您的實驗可能是至關重要的。

文章來源：每日生物評論

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