Nature 突破！生長素受體TIR1AFBs具有腺苷酸環化酶活性

責編 | 王一

生長素

（auxin）

在植物的生長髮育過程中發揮重要作用。研究植物如何感知生長素及生長素訊號在植物細胞內如何傳遞對於認識生長素的功能具有重大理論意義。基於早期遺傳學和生物化學證據，經典生長素訊號轉導通路的理論框架於2005年已基本建立：生長素受體TIR1/AFBs是F-box蛋白，透過與其它亞基互作形成有功能的SCF型別E3泛素連線酶複合體。生長素結合其受體蛋白TIR1/AFBs能夠誘導TIR1/AFBs與共受體Aux/IAAs的相互作用，並促進Aux/IAAs的泛素化修飾和降解，解除Aux/IAAs對ARFs介導的轉錄過程的抑制作用，從而啟動生長素誘導的轉錄重程式設計

（Dharmasiri et al。， 2005； Kepinski and Leyser， 2005； Parry and Estelle， 2006）

。這一理論完美地解釋了生長素對於多種生長髮育過程的調控，如胚胎髮育、器官發生、維管束髮育等。然而，近些年越來越多地證據表明生長素還能透過TIR1/AFBs介導許多快速的細胞反應，比如質膜去極化、胞質Ca

峰、質外體鹼化以及根的快速生長抑制等

（Dindas et al。， 2018； Fendrych et al。， 2018； Li et al。， 2021； Serre et al。， 2021； Shih et al。， 2015）

。

生長素在短短1分鐘左右就可以誘導這些生理反應，這無法用經典的生長素訊號轉導通路（轉錄重程式設計）來解釋，暗示生長素受體TIR1/AFBs可能仍有未知功能。

2022年10月26日，奧地利科學技術研究所

Jií Friml

教授團隊在

Nature

發表了題為

Adenylate cyclase activity of TIR1/AFB auxin receptors in plants

的研究論文。該研究發現生長素受體TIR1/AFBs除了具有E3泛素連線酶活性以外，還具有

腺苷酸環化酶

（Adenylate cyclase， AC）

活性，且AC活性對於生長素誘導的轉錄調控至關重要。該發現將為生長素訊號轉導研究開闢新的方向。

擬南芥TIR1/AFBs家族有6個成員，具有保守的蛋白結構域：N端為F-box基序，中間大部分為富含亮氨酸的重複序列

（Leucine rich repeats， LRR）

，C末端有一小段序列沒有註釋任何結構域。該研究根據已知線索進行合理推測，並結合序列分析，在TIR1/AFBs家族的C末端發現存在一個保守的腺苷酸環化酶核心基序。腺苷酸環化酶能夠以ATP為底物合成cAMP。作者進一步透過大腸桿菌AC突變體互補實驗、體外AC酶活結合ELISA或HPLC-MS/MS檢測實驗等多種方法證明：所有能夠正常表達和純化的擬南芥TIR1/AFBs具有AC活性

（圖1）

。作者進一步證明陸生植物基部類群小立碗蘚

（

Physcomitrella patens

）

的4個PpAFBs均具有AC活性，說明TIR1/AFBs家族的AC活性在進化上是高度保守的。

圖1 生長素受體TIR1/AFBs具有腺苷酸環化酶（AC）活性。

a TIR1/AFBs的C末端存在保守的AC基序；b 體外AC酶活結合ELISA檢測實驗表明AFB5具有AC活性；c-e 體外AC酶活結合HPLC-MS/MS檢測實驗證明AFB5和TIR1均具有AC活性。

為了驗證C末端AC基序對於TIR1/AFBs AC活性的重要性，作者分別突變了AFB5和TIR1ΔNT C末端AC基序中3個保守的氨基酸殘基

（ACm1， ACm2， ACm3）

。大腸桿菌AC突變體互補實驗和體外AC酶活實驗的結果均表明3個氨基酸突變均使AFB5和TIR1ΔNT丟失了AC活性，說明C末端AC基序對TIR1/AFBs的AC活性至關重要。作者進一步透過體外Pull-down實驗證明儘管ACm2破壞了生長素誘導的TIR1-IAA7互作，但ACm1和ACm3並不影響這種互作，

說明這兩個點突變可以特異地消除TIR1的AC活性，而不影響對生長素的感知。

TIR1的AC活性中心在空間結構上距離生長素結合口袋很近。作者將ATP和TIR1–IAA–Aux/IAA複合體的結構進行了分子對接

（molecular docking）

，發現ATP確實能夠和鑑定到的AC活性中心很好地結合，另外Aux/IAA降解子中的V84氨基酸殘基伸展出來，將ATP固定在AC活性中心，很有可能會增強AC活性。為了驗證這一假設，作者在進行TIR1的體外AC酶活實驗時分別加入IAA，純化的IAA7或IAA17蛋白，以及它們的組合，發現只有在同時存在配體IAA和共受體IAA7或IAA17時，TIR1的AC活性被顯著增強，說明TIR1對生長素的感知會增強其AC活性。作者進一步證明生長素處理擬南芥幼苗後，根中的cAMP顯著積累，而且這種作用完全依賴生長素受體TIR1/AFBs。

為了研究AC活性對TIR1受體功能的重要性，作者進行了突變體互補實驗。雙突變體

tir1-1 afb2-3

對生長素誘導的根生長抑制不敏感。作者用TIR1自身啟動子驅動野生型TIR1和3種AC基序突變的TIR1去互補

tir1-1 afb2-3

雙突變體表型，發現野生型TIR1能夠正常互補雙突變體表型，TIR1

ACm2

由於喪失了生長素感知能力完全不能互補，而TIR1

ACm1

和TIR1

ACm3

只能很微弱地互補，說明AC活性對於TIR1的生理功能至關重要。為了進一步驗證這一結論，作者利用了工程改造的cvxIAA/ccvTIR1系統。該系統在TIR1的生長素結合口袋中引入一個氨基酸突變從而形成“凹形”結構

（concave TIR1， ccvTIR1）

，而IAA也被對應地進行化學修飾從而形成“凸形”結構

（convex IAA， cvxIAA）

。透過這種改造，cvxIAA特異地結合ccvTIR1從而啟用生長素訊號轉導，而不能結合其它內源的TIR1/AFBs；相應地IAA只能結合內源TIR1/AFBs，而不能結合ccvTIR1

（Uchida et al。， 2018）

。因此，當含有ccvTIR1的轉基因植物被cvxIAA處理後，只有ccvTIR1介導的訊號轉導途徑被啟用，消除了TIR1/AFBs功能冗餘對解析其功能的影響。作者構建了含有ccvTIR1和AC基序突變的ccvTIR1

ACms

的轉基因植物，發現cvxIAA處理ccvTIR1植物能夠顯著抑制根的生長，而在ccvTIR1

ACms

的轉基因植物中，cvxIAA只能輕微地抑制根的生長，這些結果充分說明AC活性對TIR1受體功能的重要性。作者進一步證明TIR1的AC活性對於生理條件下根的向重力反應也是至關重要的

（圖2）

。

利用垂直顯微鏡結合微流控晶片技術，作者對根中生長素誘導的快速反應進行活體成像研究，卻發現TIR1 AC活性對生長素誘導的胞質Ca

峰和質外體鹼化等並不重要。相反，實時熒光定量PCR的結果卻表明生長素響應基因的轉錄水平在AC基序突變的轉基因材料中大大降低（圖2），

說明受體TIR1/AFBs的AC活性透過獨立於E3泛素連線酶活性的方式，參與生長素誘導的轉錄調控。

圖2 TIR1 AC活性參與生長素誘導的根生長抑制和轉錄調控。

a-b 突變體互補實驗證明TIR1的AC活性對生長素誘導的根生長抑制至關重要；c cvxIAA/ccvTIR1系統的工作原理；d cvxIAA/ccvTIR1系統進一步證明AC活性對TIR1功能的重要性；e TIR1 AC參與調控根的向重力反應；f-j 實時熒光定量PCR的結果表明TIR1的AC活性對生長素誘導的轉錄調控至關重要。

自2005年經典生長素訊號轉導通路的理論框架建立以來，生長素訊號轉導領域的研究基本再無概念性突破。

該研究證明生長素受體TIR1/AFBs除了具有E3泛素連線酶活性以外，還具有腺苷酸環化酶

（AC）

活性，而且AC活性對於生長素誘導的轉錄調控至關重要。這項發現將為生長素訊號轉導研究開闢新的方向，是該領域近15年內的重要突破。

另外，自從1958年Earl W。 Sutherland發現cAMP在動物激素腎上腺素調控糖原分解過程中起著重要的中間作用以來，cAMP作為細胞訊號轉導通路中的二級信使這一發現在整個生命科學界產生了巨大影響，相關理論知識在生物醫藥行業得到了廣泛應用，迄今為止，至少已有5項諾貝爾生理醫學獎授予了相關研究（Beavo and Brunton， 2002）。然而，cAMP對植物的重要性卻長期以來一直飽受質疑、爭議不斷，其重要性並未被廣泛認可

（Gehring， 2010； Trewavas， 1997）

。

該研究充分證明生長素受體TIR1/AFBs具有AC活性，且對其受體功能至關重要。這將有望結束這一長達半個多世紀的爭議，復甦植物cAMP相關研究，並很有可能影響整個植物訊號轉導領域的研究。

該論文的通訊作者為奧地利科學技術研究所

Jií Friml

教授。第一作者

祁林林

博士在中國科學院遺傳與發育生物學研究所取得博士學位，現在Friml教授課題組從事博士後研究。

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論文連結：

https：//doi。org/10。1038/s41586-022-05369-7