MICM整合診斷技術解析（三）：免疫學分析
在上兩期的連載內容中，
高博醫學（血液病）北京研究中心北京高博博仁醫院童春容主任
為大家介紹了MICM整合診斷中細胞形態學及細胞化學染色和組織病理學的特點，本期繼續MICM整合診斷技術中
免疫學分析
相關知識的解析。
一、概述
免疫學分析主要包括免疫組織化學染色（IHC）和流式細胞術（FCM），方法是採用不同染料或熒光染料標記的單克隆抗體（單抗，mAb）對細胞懸液、細胞塗片或骨髓組織切片進行染色，然後在流式細胞儀或熒光顯微鏡或光鏡下觀察細胞表面或細胞內的抗原標記。
免疫分析技術是確定血液腫瘤細胞系列，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、髓系細胞、自然殺傷（NK）細胞、自然殺傷性T（NKT）細胞、淋巴樣漿細胞、漿細胞、樹突細胞（DC）和非血液淋巴系統細胞等的關鍵技術。尤其是雙表型、雙克隆性、甚至多系列的血液腫瘤只能透過免疫學分析來診斷。
該技術也是確定血液腫瘤細胞分化受阻階段（早期或前體或原始，晚期或成熟或外周）的關鍵技術。以急性白血病為例，如果形態學、細胞化學染色聯合FCM，診斷與分型的準確率及一致率可達90%以上，且重複性高。
急性白血病病情發展速度很快，甚至可能在一天之內迅速惡化，因此需要快速診斷並治療。根據形態、細胞化學染色和FCM對急性白血病的診斷和分類，最快幾個小時就可明確疾病診斷，醫生可先根據這兩份結果對患者進行治療，避免延誤急性白血病的治療時機。
二、IHC
IHC一般用染料或熒光染料標記的抗體對組織病理切片的組織細胞染色，抗體與抗原結合後標記的染料顯色，可在光鏡下觀察著色反應；或熒光素髮出熒光，可在熒光顯微鏡下觀察熒光反應，從而瞭解細胞表達的免疫標誌。IHC是目前病理檢查最廣泛應用的方法，一般與組織病理普通染色同時進行。
1、
IHC的優點
病理組織標本IHC具有組織病理的優點，在此基礎上進行IHC，比FCM更容易確定某一免疫標誌陽性或陰性細胞在組織部位的定位；對一些抽不出的細胞、少見細胞、體積很大的細胞等也可判斷；一些免疫標誌用IHC檢測比FCM更準確，如細胞週期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）等。
2、
IHC的侷限性
IHC一般每次染色只能用一種抗體，但很少有一種免疫標誌是惡性細胞特有的標誌。
在免疫標記染色後，細胞形態特點不清楚，很難在不同染色切片對同一類細胞定位並確定這類細胞表達的全部標誌，尤其是對那些不破壞組織結構的血液腫瘤細胞、或血液腫瘤細胞沒有定位於特定的組織結構區域，與反應性良性細胞混合分佈的病理標本。
此外，在血液腫瘤細胞比例明顯比正常細胞少的情況下，僅根據IHC難以鑑定細胞的良惡性、惡性細胞的細胞系列及分化階段；目前有些抗體很難成功用於IHC染色和分析，如T細胞抗原受體（TCR）αβ或γδ鏈、免疫球蛋白輕鏈、TCRvβ區，因此採用IHC很難診斷γδT淋巴瘤，也很難進行成熟B細胞、T細胞的克隆性分析。
同樣，IHC的診斷醫生需要具有組織病理醫生那樣豐富的知識和經驗，還要了解IHC染色試劑的優缺點。
三、FCM
FCM是將標本製備成單個細胞懸液，然後將這些用熒光染料標記的單抗標記細胞透過流式細胞儀進行檢測的方法。流式細胞儀可以探測單個細胞的大小、細胞內顆粒的多少，及標記在細胞上的熒光光譜，並將光訊號轉化為電訊號，用計算機存貯下來，再用分析軟體進行分析。
1、
FCM的優點
流式細胞儀除了直接探測細胞的大小、細胞內顆粒的多少外，還可一次性檢測同一個細胞上3～10餘種免疫標誌是否表達、表達強度、不同免疫標誌之間的關係。
如果含有不同細胞群的標本在同一試管染不同的熒游標記的抗體，那麼就可以劃出有同樣熒游標記的一群細胞所在區域（設門），然後分析和計算該細胞群的特徵和數量。
FCM可以在幾個小時內完成對同一患者幾十萬個細胞上數百種標記的分析，比IHC更為快速、簡便，一致性及重複性更好。
FCM可檢測多種標本，如血液、骨髓、活檢組織、各種細針或粗針穿刺標本、胸水、腹水、腦脊液等多種體液，因此容易檢測血液腫瘤在其它部位的浸潤。
雖然血液腫瘤細胞上的單個免疫標誌與正常細胞差異很小，但是綜合多種免疫標誌的分析，大多數的惡性血液細胞具有一些異常表達的現象，可幫助判斷細胞的良惡性。而與形態、組織病理、IHC相比，FCM更容易判斷細胞的良惡性。
例如，惡性成熟B細胞和惡性漿細胞膜或胞漿限制性表達單一的免疫球蛋白（Ig）輕鏈（κ或λ），而正常成熟 B細胞膜或漿細胞胞漿內表達κ或λ的細胞比例一般為3：2；正常成熟 T細胞上 T細胞抗原受體抗原（TCR）為多克隆表達，而惡性T細胞 TCR抗原為某一克隆明顯增加，其它克隆明顯減少；血液腫瘤細胞還可有脫氧核糖核酸（DNA）倍體異常、抗原表達過強、應該表達的抗原丟失、不同系列細胞的抗原同時表達、早期晚期抗原同時表達、罕見細胞（如TCRγδ+T細胞等）明顯升高等。
在此基礎上，也更容易判斷惡性細胞的系列來源及成熟階段。因為很多免疫標誌在正常細胞上也存在，因此進行血液腫瘤免疫分型時應該確定免疫標誌在血液腫瘤細胞上，而不是簡單地根據某一免疫標誌的細胞的數量來判斷。
尤其是當組織中存在大量的正常細胞，腫瘤細胞比例很低時；或有正常早期細胞標誌的細胞反應性增加時；單純用IHC判斷腫瘤細胞的系列來源及分化階段可能誤診。
比如，當原始細胞只有20%，而正常粒細胞≥50%時，此時根據粒細胞標誌細胞佔全部有核細胞（ANC）的比例就診斷急性粒細胞白血病是完全錯誤的。
因此，很多免疫表型複雜的血液腫瘤用FCM來診斷比較容易，用IHC診斷卻很困難，比如同一患者存在多種惡性血液腫瘤克隆，如T、B、漿細胞、髓系共存，淋巴瘤和急性白血病共存，甚至有血液腫瘤和其它系統腫瘤共存的現象，如漿細胞腫瘤和肺癌共存等。
FCM還可以對一些轉移癌等非造血系統腫瘤做出提示性診斷，我們中心就使用FCM在組織、腦脊液、骨髓、血液等標本中查出過肺癌、神經母細胞瘤等。
由於FCM檢查的細胞數很多，分析的標記多，FCM可以檢查很微量的血液腫瘤細胞，敏感性可達10-3~10-4；且覆蓋面廣，對>80%的血液腫瘤細胞都可用FCM檢測，因此是監測治療後微小殘留腫瘤（MRD）的最常用方法，而且可以很快報告，及時調整治療方案。
血液腫瘤細胞上的一些分化抗原決定簇（CD），如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD52、CD70、CD138、CD371、BCMA等，針對這些抗原，已經有相應的抗體，嵌合性受體基因轉染的T細胞（CAR-T）等有效治療方法，因此檢測這些標記可幫助選擇靶向性的抗體或CAR-T治療。
靶向治療後，腫瘤細胞上的這些抗原還有可能丟失，因此監測這些抗原的變化可指導更精確的靶向治療。
有些免疫標誌代表血液腫瘤的預後不好，如 CD34+CD56+的急性髓系白血病（AML）、混合細胞性急性白血病（MPAL）等，因此免疫分型也有一定的預測預後的意義。
2、
FCM的侷限性
與形態、組織病理及IHC相比，FCM需要檢測液態細胞，不能觀察到病理結構，不能將細胞定位於組織部位。一些太大的細胞，如巨核細胞、霍奇金淋巴瘤細胞、多核鉅細胞等可能檢測不出。一些無免疫標記異常的細胞也難以確定其良惡性，如一些紅白血病的幼紅細胞。
此外，FCM需要將標本處理成單個細胞懸液，並染色，甚至洗滌，一些血液腫瘤細胞在標本運送、處理過程中死亡（如幼紅細胞、大B細胞淋巴瘤細胞容易破壞），可能檢測不到，或檢測的比例與形態或病理明顯不符；腦脊液、其它體液或組織的細胞，如果沒有血清等保護，或時間較長也容易破壞。
在比例方面，如果骨髓中正常幼紅細胞大量破壞，會導致有核細胞比例失常，腫瘤細胞比例高於形態或病理結果；如果腫瘤細胞破壞或標本稀釋則會導致腫瘤細胞低於形態或病理。
另外，
抽骨髓時一般第一針首先抽少量骨髓血塗片進行形態學分析，此後抽取骨髓血做染色體甚至基因，如果最後才抽取做流式分析，會導致大量血液稀釋骨髓。
一些惡性細胞與組織黏附性高，難以穿刺吸出或在組織標本時不能成為單個細胞懸液，FCM也會漏診。
還有值得注意的是，FCM診斷所用的有些標誌如CCND1不如病理敏感，因此診斷套細胞淋巴瘤要結合IHC。很多型別的血液腫瘤有共同的免疫標誌，如各類前體 B、T、髓系細胞腫瘤僅依據FCM尚不能對亞型作出準確診斷和分型。
FCM對診斷技術人員的要求也很高，需要在以下多方面有豐富的知識和經驗：血液病臨床特徵、正常細胞分化發育過程中免疫標誌的變化規律、疾病的免疫標誌特點、不同廠家不同克隆號抗體及其標記的熒光光的特點，不同熒游標記抗體組合後的變化，怎樣識別需要深入分析的目標細胞（設門），儀器及應用軟體的標準化、除錯等等。
目前FCM分析細胞引數時是一次性平面分析兩個引數，然後將多次的平面分析組合起來形成結論，這也需要FCM診斷醫生有豐富的知識和經驗。
FCM需要分析活的細胞，需要的細胞數量多，對活性不好的細胞容易出現非特異染色，細胞數量很少的標本容易導致分析不全面，容易出現誤診或漏診。
3、
FCM相關專家共識、標準、指南的解讀
2008和2016世界衛生組織造血與淋巴組織腫瘤分類的標準中提出了區分不同階段、不同系列血液腫瘤的免疫標誌特點。但是FCM判斷是否為血液腫瘤細胞不僅僅根據細胞上表達什麼標誌，還要透過分析細胞上多種抗原表達和組合異常來判斷是否為血液腫瘤細胞，然後再判斷血液腫瘤細胞的比例、成熟階段及系列來源。
FCM診斷的正確性與標本處理方式、儀器校準、檢測抗體的選擇、抗體組合、目標細胞的設門、抗原表達比例及強度的判斷，診斷醫師分析的仔細程度、知識水平及經驗等因素都有關，目前國內外不同單位的檢測結果尚不易被互認，尤其對血液腫瘤細胞比例很小的MRD的監測，差異及分歧很大。國際上一些協作組監測MRD時，一般僅選擇幾個實驗室來報告。
為了減少不同實驗室之間的報告誤差，國際上先後出臺了一些FCM診斷血液腫瘤的專家共識。
國際血液
學
標準
化
委員會（
ICSH
）
、國際臨床流式學會（ICCS） 、
歐洲白血病網路（ELN）、英國血液學標準委員會（BCSH）等都
制定了一系列的FCM診斷血液病的實踐指南。
隨著FCM知識的普及，國內FCM實驗室在診斷血液腫瘤方面有很大進步，但是對淋巴瘤的診斷及分型，很多腫瘤醫院或腫瘤科尚未把FCM列為常規診斷，因此尚需要努力普及宣傳這方面的知識。
專家介紹
童春容
高博醫學（血液病）北京研究中心北京高博博仁醫院
高博醫學（血液病）研究中心免疫與靶向治療學科帶頭人，高博醫學（血液病）北京研究中心北京高博博仁醫院科研院長。
血液一科（普通血液病）主任，從事血液內科臨床工作及實驗研究30多年。
擅長各類惡性血液腫瘤的整合診斷（整合臨床病史及多種實驗室診斷技術）及綜合診療（化療、免疫治療、靶向治療、中藥等），注重個性化精準診療，尤其擅長血液腫瘤的免疫治療。
為國內較早一批開展免疫治療的專家之一，在CAR-T細胞治療難治復發血液腫瘤領域為國際領先水平，獲得國際學術界的認可。領導團隊與企業合作聯合在國內率先採用新型第二代CD19-41BB-CART CAR-T細胞治療難治復發的急性B淋巴細胞白血病；此後聯合開發了多種靶點的CART臨床用於治療血液腫瘤，包括CD1a、CD4、CD7、CD20、CD22、CD30、CD33、CD70、CD79b、CD123、CD138、CD371等。是國內外開展CART臨床研究病例數及種類最多的中心治療之一。多開發項研究成果在ASH、EHA、JSH上展示，多篇論文被《Leukemia》、《Blood Cancer Jour》等著名雜誌收錄。還注重發展多種免疫治療技術，如新抗原免疫治療等治療血液腫瘤及實體瘤等。
作者 | 童春容
編輯 | 趙薇
