貼瓶率測試培養基

培養基在過濾的過程中有可能受有毒物質的汙染。例如，一些濾器為了容易保持溼潤而用微量去汙劑處理過，當過濾培養基時，這些去汙劑可能會進入培養基中。這種濾器應該在使用前先過濾一些D-PBSA或BSS達到清洗的目的，或者是棄掉前面的過濾液。聚碳酸酯濾器（如 Nuclepore）不用去汙劑處理即可溼潤，一些人喜歡用它，尤其是在過濾血清濃度低的培養基時。

培養物檢測主要有3種形式：①貼瓶率；②在正常培養密度和達到飽和密度時的生長曲線；③特殊功能的表達（例如，誘導劑存在下的分化，病毒繁殖，特殊產物形成或特異抗原表達）。所有這些對新培養基的檢測都應以常規培養基作為對照。

貼瓶率檢測是最敏感的培養檢測，可檢測到輕微的營養不足和低濃度的毒素，這些在細胞密度較高時是不明顯的。這種檢測最好應在有限的血清濃度下進行（如果需要使用血清），否則會掩蓋培養基中的營養不足。接下來用A549細胞來進行測試，在10%血清培養條件下，其貼瓶率大約為50%，5%時貼瓶率大約為10%，但最好先測定一下將用於實驗的細胞的貼壁率，並且是在限制血清濃度（如5%）的條件下。

用貼瓶率測試培養基具體如下：

概要

接種低密度細胞，溫育至集落形成；染色，統計集落數。

材料

無菌

貼壁細胞，如A549，培養至對數期（參見圖2）

對照生長培養基；常規的DMEM/F12 5% FBS 100mL

測試生長培養基：常規的 DMEM/F12 含 5% FBS 100mL

粗製胰蛋白酶，0。25% 10mL

Petri培養皿，6cm 20個

試管或常規容器，用於稀釋20

紅細胞計數器或電子細胞計數儀

固定用無水甲醇 100mL

D-PBSA 200mL

染液：結品紫100mL

過濾漏斗和濾紙（用於回收染液）

操作步聚

胰蛋白酶消化細胞產生單細胞懸液。

細胞消化的過程中：

（a）在培養皿的底部做上標記：

（b）量出培養基用於稀釋，每個稀釋度需要3份，培養基要夠用有餘。

3。細胞變圓開始脫落：

（a）用含血清或某種胰蛋白酶抑制劑的培養基吹打單層細胞：

（b）細胞計數；

（c）將細胞稀釋至

（i）2x104個/mL用於接種兩個25cm培養瓶，常規培養；

（ii）2x103個/mL，是系列稀釋的最高濃度；

（iii）用（ii）液稀釋5個梯度，達到200個/mL、100/mL、5個/mL、20個/mL、10個/mL

4。接種至培養皿，每個皿5mL 培養基，分別含（iii）所製備的5種細胞濃度。接種兩個6cm 培養皿，每個皿的細胞濃度為2x103個/mL，在克隆化培養失敗時可作為對照（以證明至少在最高濃度時有細胞存在）。

5。用5%CO充入培養瓶，放到培養箱中。

6。將Petri培養皿放在透明的塑膠盒中，再放置在溫潤的CO2溫箱中，克隆化培養過程中最好少觀察。

7。培養至肉眼可見細胞集落（1~3周）。

8。用結晶紫對集落進行染色。

（a）去除培養皿中的培養基。

（b）用D-PBSA 沖洗細胞，丟棄沖洗液。

（c）加5mL新鮮的D-PBSA，再加入5mL甲醇，輕輕混勻（避免集落脫落）。

（d）用5mL 新鮮的甲醇替換50：50（D-PBSA：甲）的混合液，固定細胞10min。

（e）丟棄甲醇，每個6cm培養皿加入純的結品紫染液 2-3mL，確認覆蓋了整個生長表面。

（f）染色10min。

（g）移除染液，將染液過濾後回收至染液瓶中。

（h）用水沖洗培養皿，乾燥。

9。統計每個皿中的集落數，不包括小於50個細胞的集落。使用放大檢視器有助於統計集落數。

注意事項：必須設定一個臨界值，高於此數值的可以統計在內。如果大多數集落的細胞數在一百至幾千，就將臨界值設定在每個集落 50個細胞。在實踐中，用肉眼觀察時，很自然就會確定這個臨界值。然而，如果集落很小（<100個細胞），臨界值就要設定在每個集落16個如細胞。低於16個細胞時（相當於細胞連續分裂4次），難以想象這些細胞能夠繼續增殖。

如果將血清濃度降至5%，只有很小或沒有影響，就再降至2%，甚至1%，再重複做實驗，並把此濃度作為正確的有限濃度用於進一步的測試。一個克隆生長測試，不是總能測出某種成分的量的不足，除非測量克隆的大小。舉例來說，如果一種或多種氨基酸的濃度偏低，可能不會影響貼瓶率測試，但會影響克隆大小的平均值。由於這個原因要進行生長曲線的測試。