磷酸化蛋白質組學對三陰性乳腺癌細胞死亡的機理探究
前言
2020年1月，Maarten Altelaar課題組在Mol Cell Proteomics雜誌（IF=4。87）發表題為“Combined EGFR and ROCK inhibition in TNBC leads to cell death via impaired autophagic flux”的研究論文，該研究運用磷酸化蛋白質組學報道了EGFR 和ROCK兩種抑制劑可促進三陰性乳腺癌細胞死亡，本文對其具體的作用做了深入的探索與反覆驗證。
中文標題：EGFR和ROCK的雙重作用可透過提高自噬通量導致三陰性乳腺癌細胞死亡
研究物件：MDA-MB-231 和 Cal120 細胞
發表期刊：Mol Cell Proteomics
影響因子：4。87
運用生物技術：蛋白組質譜鑑定；western blot；磷酸化蛋白質組學
研究背景
三陰性乳腺癌是一種臨床上很難治癒的乳腺癌亞型。有報道顯示EGFR和ROCK的雙重作用可以導致細胞死亡，但是其作用機制尚不明確。為了進一步探究其作用機制，Maarten Altelaar教授團隊基於質譜蛋白質組學，研究了EGFR和ROCK單獨或者雙重處理後，TNBC細胞中的蛋白質表達變化。結果發現，吉非替尼的單獨處理導致細胞發生自我吞噬，然而EGFR和ROCK同時處理細胞則封鎖了細胞吞噬過程，從而導致吞噬小泡的積累。
研究思路
研究方法
1.實驗材料
MDA-MB-231和Cal120 細胞（全部排除支原體汙染）；吉非替尼（EGFRi， MedChem），GSK269962A（ROCKi， Axon）。
2.檢測方法
（1）分別使用DMSO， EGFRi，ROCKi 和 （EGFRi+ROCKi）處理2天后，收集MDA-MB-231和Cal120 細胞，每種細胞3次技術重複。
（2）深度蛋白組：每個樣本取50μg混合，pH=10流動相下梯度分離，最終合併為5個組份。
（3）磷酸化蛋白質組學：Fe（III）-IMAC富集磷酸化肽段，然後使用QE HF質譜儀進行鑑定。
（4）Western Blot：共驗證以下7個蛋白：LC3 （5F10， Nanotools）， p62 （610832， BD Biosciences）， AMPKThr172 （40H9， Cell Signaling）， rpS6 （5G10， Cell Signaling）， rpS6Ser235/236 （Cell Signaling）， Hsp90 （sc-7947，Santa Cruz）， Actin （AC-74， Sigma）。
（5）透過Cyto-ID染色對細胞自噬通量進行檢測與定量。
研究結果與討論
1.不同條件處理下細胞變化
使用DMSO （control）， gefitinib （EGFRi）， GSK269962A （ROCKi） 和（EGFRi+ROCKi）混合抑制劑分別處理四組細胞（樣本策略），可以明顯地看出EGFRi+ROCKi抑制了細胞的增長（Figure 1A）。進一步，做了全蛋白組和磷酸化蛋白質組測定，共定性出7169個蛋白質和22758個磷酸化位點（Figure 1B），選擇其中至少在兩個重複中有定量值的蛋白和位點進行後續分析。從Figure 1C和Figure 1D均可以看出，本次實驗的技術重複性很好，且不同處理組之間也能很好的區分開。
圖1 | 實驗流程與質譜資料展示
2.蛋白組定量資料聚類及GO分析
透過ANOVA統計分析，共篩選出995個表達差異蛋白，並對差異蛋白進行HCA聚類，結果共得出3個大類，即1類EGFRi+ROCKi處理後下調的蛋白（cluster A）和2類上調的蛋白（cluster B和cluster C）。分別對三個分類進行GO分析，結果顯示cluster A中的下調蛋白與細胞粘附、染色質重組等生物學過程相關。Cluster B的上調蛋白與氧化還原等，尤其是細胞自噬相關。Cluster C的高表達蛋白則與胞內蛋白轉運、細胞粘附等密切關聯。
圖2 | 不同處理後細胞蛋白組聚類
3.細胞自噬相關蛋白的差異表達
EGFRi、ROCKi和 （EGFRi+ROCKi）混合抑制劑分別與DMSO對照組處理的蛋白定量值進行差異篩選（Figure 3A），並展示了這些差異蛋白中與細胞自噬等生物學過程相關蛋白之間的相互作用，因此發現了LC3、rpS6等重要的細胞自噬受體（Figure 3B）。
圖3 | EGFRi， ROCKi 和 EGFRi+ROCKi不同處理後細胞蛋白組與對照組的差異表達
4.Western blot驗證細胞自噬相關的蛋白標誌物
首先，選用MDAMB231細胞驗證在四種預處理過程中，自噬標誌物的表達變化和rpS6的磷酸化水平，結果顯示在EGFRi+ROCKi的雙重作用時，rpS6的磷酸化修飾被顯著抑制。然後，選用Hs578T、Cal120和HCC1806細胞驗證LC3-II的表達變化和rpS6的磷酸化，結果再次印證了rpS6的磷酸化受到EGFRi+ROCKi雙重作用的抑制，且LC3-II表達明顯升高。
圖4 | 蛋白標誌物的抗體驗證
5.細胞自噬流分析
培養Hs578T細胞，分別使用EGFRi和EGFR+ROCKi抑制劑進行處理，然後透過Cyto-ID對自噬小泡進行熒光計數，結果發現，使用EGFR+ROCKi混合抑制劑處理後的細胞自噬作用加強（Figure 5），因此進一步印證EGFR和ROCKi的雙重作用對增強三陰性乳腺癌細胞的自噬作用顯著提升。
圖5 | EGFRi與混合抑制劑分別對細胞自噬的影響
實驗結論
本文透過蛋白質組學資料分析發現EGFR和ROCK對三陰性乳腺癌細胞的雙重作用可以增強其自噬作用，從而導致癌細胞死亡，並從多個角度進行驗證，從而為該癌症的臨床治療提供了理論依據。
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三陰性乳腺癌在臨床上的治癒效果不佳，給病人和家屬造成極大的痛苦。本文研究中，作者透過蛋白質組學和磷酸化位點鑑定的方式，觀察了不同藥物對於細胞自噬的影響，初步確認了EGFR和ROCK雙重作用可提高細胞自噬，促進細胞死亡。然後又透過Western blot和熒光計數計數，進一步驗證了以上結論，為臨床藥物治療提供了有力的理論依據。
部分參考文獻：
1。Foidart， P。， et al。， Expression of MT4-MMP， EGFR， and RB in Triple-Negative Breast Cancer Strongly Sensitizes Tumors to Erlotinib and Palbociclib Combination Therapy。 Clin Cancer Res， 2019。 25（6）： p。 1838-1850。
2。Bryant， K。L。， et al。， Combination of ERK and autophagy inhibition as a treatment approach for pancreatic cancer。 Nature Medicine， 2019。
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文章來源於鹿明生物
