弧菌實用檢測方法及實驗器材試劑

一、弧菌檢測器材和試劑 （水產養殖戶簡易實驗室用）

①電爐一臺

②天平（0。1克）1個

③一次性無菌培養皿（90mm）10個

④100ml量筒1個

⑤三角燒瓶（500ml）1個

⑥250ml燒杯1個

⑦無菌巴氏滴管若干支，或移液槍一支（配套無菌吸頭）

⑧酒精燈1個

⑨酒精1瓶

⑩三角塗布棒1個或無菌L型塗布棒

⑪玻璃棒1支

⑫TCBS培養基1瓶（北京陸橋產，貨號CM402）

⑬無菌取樣瓶若干（按取樣數）

⑭接種環 1支 或一次性無菌接種環

⑮小型恆溫培養箱 1臺

二、樣品採集

1、用無菌取樣瓶採集水下約20cm處水樣，採好的水樣需蓋緊瓶。

2、採得的水樣立即送檢，否則，應將樣品置於冰瓶或冰箱中，但也不得超過24h，否則將影響檢驗結果。

三、檢驗步驟

1、培養基稱量煮沸倒平板

1） 稱量8。91克TCBS瓊脂粉（可按比例增減）和100ml蒸餾水或純淨水（沒有條件的用冷卻開水或桶裝水），倒入洗淨的三角燒杯中，加熱攪拌，溶解瓊脂粉，直至沸騰。

培養基溶解判定標準：輕搖三角瓶，掛在瓶壁上的液體裡沒有顆粒，即為全部溶解。難溶解的顆粒為瓊脂，顆粒溶解不充分的話，製作的培養平板易破，不耐用。

2）在滅菌操作檯上，將沸騰後的培養基冷卻到50~60℃，分別倒入一次性無菌培養皿中，每個培養皿約15~20mL，待其冷卻凝固，倒置於超淨工作臺或無菌泡沫箱內儲存備用。

注意：倒好的平板內不能有水珠或水層。 ，如平板表面有水珠，可放在25 ℃~50 ℃的培養箱裡乾燥，直到平板表面的水珠消失。

2、菌液接種

在滅菌操作檯上，用無菌巴氏滴管或（無菌槍頭）取水樣（可稀釋）0。05mL（2~3ml無菌巴氏滴管一滴約50微升），滴入制好的培養皿培養基上，用滅菌的三角塗布棒將菌液塗抹均勻，平放於操作檯上數分鐘，使菌液滲入培養基。 （沒有超淨工作臺的，應選相對潔淨的環境，現用現配，在火焰旁操作。）

3、弧菌培養

將接種培養皿倒置恆溫培養箱箱內培養，於36 ℃±1 ℃培養18 h~24 h左右，取出計數菌落。在通常情況下，塗布後，將平板靜置 10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱 36 ℃±1℃培養1 h；等樣品勻液吸收後翻轉平皿，倒置於培養箱，

如不是在恆溫培養箱用37℃培養，在室溫環境培養，由於室溫溫差的原因會嚴重影響弧菌菌落形成的數量和時間。

4、菌落計數

分別點數綠色菌落和黃色菌落數量，乘取水樣的稀釋倍數，即可得該水樣的綠色和黃色弧菌總數。

典型的副溶血性弧菌在TCBS 上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環輕觸，有類似口香糖的質感，直徑2 mm~3 mm。

注意:

選用TCBS作為分離培養各種弧菌的培養基，特異性不是很強；不少細菌在TCBS上也能生長，但生長較慢，需要培養24h後方可長成0。5~1mm的黃、綠色菌落。為有效排除干擾，及時準確地判斷出是否存在弧菌屬細菌，可結合弧菌屬細菌在TCBS培養基上生長的特點：弧菌生長快，菌落大，培養4-5h原劃線處有菌苔生長，8-10h可長出小菌落，16h菌落可達2mm；其他菌在TCBS上則無此特點。因此在篩選弧菌屬細菌的選擇性培養基時要特別注意在確定的培養時間內進行菌落的觀察，時間超過即影響其準確性。