如何使用實時熒光定量 PCR 法來進行無乳鏈球菌血清的分型？

B組鏈球菌（GBS） 是一種熒光檢測帶有包膜的革蘭氏陽性菌，是新生兒侵襲性感染敗血症和腦膜炎的重要原因，GBS血清抗體傳統分型法通常需要經過乳膠凝集、多重 PCR 和條帶大小分析或全基因組序列分析等步驟，過程繁瑣，技術成本昂貴，所以在PCR實驗室中採用

實時熒光定量PCR

法進行血清分型不僅可以替代乳膠凝集法，還可以改進 GBS 血清型資料的採集。

GBS

細菌菌株

分離與培養

將GBS 分離株在胰蛋白酶大豆 （TS） 或 5% 羊血瓊脂平板上於37°C 培養，然後在 TS 培養基中於 37°C 培養過夜。

熒光定量PCR

透過乳膠凝集進行血清分型

根據製造商的說明，使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 試劑盒（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）透過乳膠凝集對所有 GBS 分離株進行血清分型。簡而言之，將 10 μl 乳膠試劑新增到懸浮在 10 μl 鹽水中的單個 GBS 菌落中。如果 30 秒後可見凝集，則旋轉反應並解釋為陽性。

實時熒光定量

法

PCR

進行

血清分型

設計引物和探針以擴增無乳鏈球菌每種血清型的多糖莢膜基因的區別區域。引物中的寡核苷酸未經修飾和脫鹽，探針用熒光探針（5‘ 6-羧基熒光素 （6-FAM））和兩種猝滅劑標記，並透過高壓液相色譜法純化。

pcr

PCR實時熒光定量分析

使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 從 GBS 的過夜培養物中提取基因組 DNA。PCR 反應最終體積為 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7。4 μl 無菌水、0。2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0。2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0。2 μl 探針（100 μM 儲備液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在 熒光定量PCR儀器上進行三次反應，並進行軟體分析。反應引數如下： 50°C 初始孵育 2 分鐘；在 95 °C 下初始變性 10 分鐘；在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分鐘下進行 35 個 PCR 迴圈。陽性反應定義為迴圈閾值（CT ） < 30 對於 50 ng DNA 模板/反應。每次執行都包含陰性對照反應（無 DNA 模板）。實驗結果與乳膠凝集進行比較。透過對比實驗發現使用

實時熒光定量 PCR

方案檢測到預測序列，並且與任何其他血清型引物/探針組合沒有陽性反應。而後透過乳膠凝法集確認了 47 株菌株的血清型，由此驗證基於 PCR 的方法和乳膠凝集方法的血清分型結果無差異。

實驗方法對比

我們知道用於 GBS 血清分型技術的基於非核酸的實驗室方法成本較高，並且需要高滴度的血清型特異性抗血清，並且會阻礙 GBS 血清型流行率的研究。而乳膠凝集試劑盒可若用於實驗室的 GBS 血清分型，其價格也較貴。透過分子莢膜分型技術，包括多重 PCR

全基因組序列的靶向分析新可用的序列資訊的適應性和相對容易的效能，但僅能分血清型 Ia、Ib 和 III 三種血清型。

與許多現有方法不同，實時 PCR 法的血清分型不是基於操作員對生化反應的解釋，它允許特異性鑑定 GBS 血清型，儘管會受到其他細菌 DNA 的干擾，但它可能在流行病學研究的背景下比較有用，作為現有多重 PCR 檢測的替代方法。隨著進一步的發展，這種新方法可以直接從標本中檢測 GBS 血清型，而無需培養。這種方法基於實時 PCR 的血清分型雖然便捷，但檢測由於需要特定的引物-探針組所以暫時無法直接識別新的血清型。