尿液cfDNA的研究現狀及樣本準備方法總結
前言
隨著液體活檢在腫瘤領域中的應用越來越常態化，其中的明星成分“循環遊離DNA（cfDNA）”也成為研究者口中的常客。雖說液體活檢是檢測包括血液、尿液等體液中的cfDNA，不過細心的老師們會發現血液cfDNA的研究數遠超其它液體樣本型別。以尿液樣本為例，小編在NCBI上檢索發現，血液cfDNA的相關成果大約是尿液的20倍。今天我們就一起來探討一下這種現象背後的原因，以便更好地推進尿液樣本中cfDNA的相關研究。
液體活檢相對應的是咱們大家所熟知的組織活檢，但我們都知道組織活檢首先需要獲取組織樣本。而組織樣本的獲取存在一定的困難，比如不能實時多次取樣、有些患者因自身病情的限制無法獲得組織樣本，而且組織樣本的獲取過程會給患者帶來很大的痛苦，甚至還有一些研究發現組織活檢取樣時可能會導致病灶轉移等。這時就出現了液體活檢，透過檢測血液等體液樣本中的物質來進行腫瘤的相關研究。體液樣本獲取的優勢在於可以實時、多次取樣，而且對患者造成的創傷很小或者是完全無創。
圖1 使用非血液來源的ctDNA研究不同癌症的例子[1]
尿液cfDNA檢測的優勢及存在的問題
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相對於血液樣本，尿液樣本cfDNA的檢測更有優勢［2］。主要體現在尿液樣本採集更方便，不需要專業人員的操作；尿液樣本可以算是真正意義上的無創檢測；尿液樣本體積大，可以滿足各種檢測的樣本量要求；可以實現多個時間點的縱向取樣等。尿液cfDNA來源於腎等泌尿系統中的器官上皮細胞脫落及少量的白細胞等，其在患者中的含量高於健康人群，所以是研究泌尿系統癌症如膀胱癌、腎癌的理想選擇。
雖然尿液樣本存在這麼多優勢，但目前尿液cfDNA的檢測以及成功應用卻非常少。主要歸因於以下幾個方面：尿液的成分比較複雜，尤其是DNA酶的活性比血液中更高，所以更容易造成cfDNA的降解［3］；尿液中存在大量的微生物，容易導致尿液樣本失效；尿液樣本cfDNA的半衰期是2。6-5。1個小時，cfDNA片段的降解程度更高；與血液樣本相比，尿液中cfDNA的長度更短，且存在多個峰值，我們不能照搬血樣cfDNA的檢測方法；目前缺少標準化的尿液cfDNA樣本的儲存或者分析方法。所有這些都限制了尿液cfDNA的應用。
尿液cfDNA的研究進展
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誠然，尿液cfDNA的研究存在諸多挑戰，但研究者們一直致力於解決這些問題，以便更好地將尿液樣本應用到臨床診斷中。目前在癌症早期診斷、泌尿系統腫瘤和腎移植後功能障礙監測方面都有應用成果發表，甚至在其它腫瘤中也有研究探索了尿液cfDNA檢測的應用。在胰腺癌研究中，對健康對照、兒童患者和胰腺癌成年患者的血漿和尿液樣本進行檢測，結果發現健康人尿液cfDNA的片段化與患者之間存在差異，在某些區域患者樣本比健康對照的片段化程度更高，且多位癌症患者cfDNA片段分佈以及長度均相似 ［3］。在神經膠質瘤患者中進行尿液cfDNA的檢測，發現即便只得到微量的cfDNA，但也有可能發現致病突變。膀胱癌患者中，尤其是晚期患者的尿液cfDNA濃度要高於正常人群或者良性泌尿系統疾病的患者。在疾病復發監測方面，出現疾病進展的患者中尿液cfDNA的濃度更高。還有研究者在尿液cfDNA中尋找監測和鑑別移植腎臟損傷的標誌物。除此之外，還有研究者開發了尿液cfDNA儲存管，以及專門研究尿液cfDNA的方法，如UroSEEK和基於尿液的CAPPseq法。雖然目前很多研究都處於初步探討階段，但對尿液cfDNA的應用奠定了良好的基礎。
尿液cfDNA樣本的採集及儲存方法
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目前還沒有標準的尿液cfDNA的樣本採集和儲存方法，不過可以查到老牌streck有用於尿液cfDNA研究的樣本保護液以及上文中提到的有研究者開發的尿液cfDNA儲存管。另外，小編從事研發的小夥伴還使用過streck血液採集管嘗試尿液樣本的儲存。由此可以看出尿液的儲存方法可謂百花齊放，這裡我們也整理了幾種文獻裡用到的方法供大家參考。
1
2020年發表在Nat Med雜誌上的題為Detection of renal cell carcinoma using plasma and urine cell-free DNA methylomes的研究中的方法：
將尿液樣本收集在無菌尿液樣本容器中，並在3小時內進行及時處理。2500g離心10分鐘，將上清液按照1-2mL的規格進行分裝並儲存在-80度備用。後續提取cfDNA時使用的試劑盒是Qiagen genomic DNA extraction Kit，使用的尿液體積是2mL。
2
2021年發表在Sci Transl Med雜誌上題為“Analysis of recurrently protected genomic regions in cell-free DNA found in urine”研究中的方法：
對收集完成後1小時內的尿液樣本進行處理，向40mL尿液中加入0。8mL的0。5M的EDTA，並分裝成10mL一份，隨後1600g離心10分鐘，並儲存在-80度。使用MagMAX Cell-Free DNA Isolation試劑盒從10mL尿液中提取cfDNA。
3
2021年發表在EMBO Mol Med雜誌上題為“Fragmentation patterns and personalized sequencing of cell-free DNA in urine and plasma of glioma patients”研究中的方法：
尿液樣本採集完成後立即置於冰上，在收集後一小時內加入0。5M的EDTA，並在4度條件下1500g離心10分鐘，收集上清液後20000g再次離心10分鐘，隨後按照2mL的標準進行分裝並儲存在-80度。使用全自動核酸提取儀QIAsymphony進行cfDNA的提取。
4
2021年發表在PLoS Med雜誌上題為：“Urine tumor DNA detection of minimal residual disease in muscle-invasive bladder cancer treated with curative-intent radical cystectomy： A cohort study”研究中的方法：
收集不同個體的尿液樣本（個人尿量有差異，在22-90mL範圍內）於含EDTA的無菌瓶中。樣本在室溫條件（20度左右）下2000g離心10分鐘，離心完成後將上清液轉移到新管中並儲存在-80度。
5
2021年發表在J Clin Microbiol雜誌上題為“Diagnosing Pulmonary Tuberculosis by Using Sequence-Specific Purification of Urine Cell-Free DNA”研究中的方法：
尿液樣本收集後儘快與EDTA和Tris-HCI（PH 7。5）混合，使兩者的最終濃度為25mM和10mM，隨後將尿液儲存在DNA LoBind tubes中放置在-20度，使用乾冰運輸到目的地後儲存在-80度。後續使用時先將尿液在37度條件下解凍後8000g離心5分鐘去除細胞碎片。
從上述5個研究提供的方法可以看出，尿液cfDNA樣本的處理和儲存方法各異。不過也存在一些共性的地方，比如採集完成後需要儘快對尿液樣本進行處理、需要使用EDTA來保護cfDNA，這與一些研究得出的結論相一致，即EDTA可以在室溫下保持尿液cfDNA的穩定性。反觀在咱們自己的研究中，如果用到尿液cfDNA樣本的儲存和處理時最好先根據前期的進展總結一套方法並進行預實驗，驗證方法可行後再進行大規模研究。
參考血液cfDNA的研究現狀，小編覺得如果想加速尿液cfDNA的研究，一方面我們需要從基礎研究入手，解決尿液cfDNA穩定性的問題。另外，需要專家及商業化機構一起努力，早日形成一套標準的尿液cfDNA樣本的儲存和分析方法。所謂“道阻且長，行則將至；行而不輟，未來可期”。讓我們一起期待尿液cfDNA在不久的將來可以大放異彩。
參考文獻
1、Ann Tivey， et al。 Circulating tumour DNA — looking beyond the blood。 Nat Rev Clin Oncol。 2022 Sep；19（9）：600-612。
2、Qiang Zhou， et al。 A novel urine cell-free DNA preservation solution and its application in kidney transplantation。 Nephrology （Carlton）。 2021 Aug；26（8）：684-691。
3、Havell Markus， et al。 Analysis of recurrently protected genomic regions in cell-free DNA found in urine。 Sci Transl Med。 2021 Feb 17；13（581）：eaaz3088。
4、Pier Vitale Nuzzo et al。 Detection of renal cell carcinoma using plasma and urine cell-free DNA methylomes。 Nat Med。 2020 Jul；26（7）：1041-1043。
