MPB：上海交大王風平組-海洋沉積物樣品細胞提取及熒光顯微鏡計數法
海洋
沉積物樣品細胞提取及熒光顯微鏡計數法
Cell Extraction of Sediment Samples and Fluorescence Microscope Counting Method
牛明楊
1， #
，賈澤宇
1， #
，王風平
2，
*
1
生命科學技術學院，上海交通大學，上海；
2
海洋學院，上海交通大學，上海
*通訊作者郵箱： fengpingw@sjtu。edu。cn
#
共同第一作者
摘要：
本實驗建立了從海洋沉積物中分離和收集細胞的方法。主要利用EDTA，吐溫80，焦磷酸鈉和甲醇作為分離洗脫劑，結合低頻率超聲處理和Nycodenz密度離心，從而有效地將細胞從沉積物顆粒上洗脫分離出來，同時減少細胞在洗脫分離過程中的破碎率。此方法適用於不同沉積物樣品中細胞的提取，且透過 0。22 m 濾膜收集細胞，經過SYBR Green I 染色，可在熒光顯微鏡下對細胞進行觀測和計數。
關鍵詞
：
沉積物細胞提取，細胞染色，細胞計數，熒光顯微鏡
實驗基本原理
海洋沉積物中含有大量的礦物質和有機質等顆粒，微生物會附著在顆粒物的表面或者被這些顆粒物包裹。這會阻礙我們對沉積物中微生物多樣性和生態功能的研究。本實驗主要透過化學試劑對顆粒物進行溶解、超聲破碎和密度梯度離心的方法使細胞和顆粒物分離，並收集細胞。實驗可分為3個步驟，基本原理如下：
1。 甲醛溶液固定細胞：甲醛可以與細胞中某些氨基酸結合發生反應，使蛋白質交聯，致使細胞失活，起到固定細胞的作用。
2。 化學、超聲剝離細胞：沉積物顆粒物中含有大量的碳酸鹽和礦物質，化學法是利用乙酸溶解碳酸鹽，使附著在碳酸鹽顆粒上的細胞解離；而加入甲醇和去汙劑溶液（吐溫和焦磷酸）有助於有機質（蛋白質）顆粒的解聚和溶解。而EDTA可以螯和金屬離子，改變礦物對細胞的吸附。超聲的方法可以打碎細胞團或者顆粒，有助於細胞的脫離顆粒物。
3。 密度梯度離心：可以利用不同濃度的Nycodenz溶液配製成密度梯度，透過離心，使得不同密度的細胞分佈在不同的密度梯度中，大顆粒沉降到管底。實現細胞與顆粒物分離的目的。
4。 熒光染色：熒光染色是透過SYBR Green I染液，是一種能夠結合雙鏈DNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料，在遊離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但是與雙鏈DNA結合後，熒光強度大大增強。可以透過熒光顯微鏡檢測到熒光訊號。
材料與試劑
實驗試劑：
1。 多聚甲醛 （上海泰坦科技有限公司，catalog number： 410730010）
2。NaCl （國藥集團化學試劑有限公司，catalog number： S9625-500G）
3。 1 0X磷酸緩衝鹽溶液 （10 X PBS溶液，pH =7。4，Sigma， catalog number： P5368）
4。 乙酸鈉 （Sigma， catalog number： S5636）
5。 乙酸 （Sigma， catalog number： A6283）
6。 Nycodenz （Axis-Shield， catalog number： 1002424）
7。 SYBR Green I 10000×原液 （Invitrogen
TM
， catalog number： S7563）
8。甘油（國藥集團化學試劑有限公司，catalog number： G7757-500ML）
9。甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，catalog number： 179957-1L）
10。 0 。5 M乙二胺四乙酸二鈉溶液 （北京索萊寶科技有限公司，catalog number： E1170）
11。十水焦磷酸鈉 （國藥集團化學試劑有限公司，catalog number： 205975000）
12。吐溫80 （國藥集團化學試劑有限公司，catalog number： 278632500）
13。 沉積物細胞固定液 （見溶液配方）
14。 醋酸緩衝液 （pH = 4。6） （見溶液配方）
15。 3%的NaCl的PBS溶液（見溶液配方）
16。 1 X磷酸鹽緩衝液（見溶液配方）
17。 去汙劑混合液 （見溶液配方）
18。 梯度密度Nycodenz溶液 （見溶液配方）
19。 100 X SYBR Green I染液 （見溶液配方）
20。 50%甘油保護液 （見溶液配方）
實驗器材：
1。離心管（2mL， Axygen，USA，catalog number： MCT-200-C）
2。肖特瓶（100mL，Schott，German，catalog number：21801245）
3。0。22 μm聚碳酸纖維膜 （GTBP） （Millipore，Billerica， MA， USA，catalog number： GTBP02500）
4。濾膜襯墊紙 （whatman GF/C，catalog number： 1822-055）
5。0。22 μm針式過濾器 （Millex
®
GP，catalog number： SLGPR33RB）
6。布氏漏斗（PALL，USA，25mm，catalog number： 4204）
7。膠塞（成陽實驗室，catalog number： 10025574028902）
8。抽濾瓶（蜀牛玻璃抽濾瓶500ml，catalog number： 45264074266）
儀器裝置
1。離心機 （Eppendorf 5430德國Eppendorf公司）
2。渦旋儀 （Vortex Genie
®
2 Vortex，美國MO BIO公司）
3。移液槍 （10 μl， 200 μl， 1 ml，德國Eppendorf公司）
4。高壓滅菌鍋 （G154DWS，中國 致微（廈門）儀器有限公司）
5。配備FITC濾光塊的Nikon ECLIPSE 90i全自動科研級顯微鏡 （ECLIPSE 90i， 日本Nikon公司）
6。真空泵 （津騰GM-0。5B，中國津騰公司）
7。超聲波破碎儀 （Thermofisher，FB50220，美國Thermofisher公司）
8。電磁加熱攪拌器 （TH-500，中國，上海滬西分析儀器廠）
9。耐高溫磁性攪拌子
實驗步驟
一、實驗器材滅菌
1。濾膜襯墊紙放入超淨臺，開啟紫外燈滅菌30min。布氏漏斗，膠塞和抽濾瓶121 °C高壓滅菌，然後烘乾使用。
2。需有陰性對照確保各環節試劑無汙染。即過濾各所用試劑對應體積於濾膜上，對濾膜進行SYBR Green染色計數。確保未能觀察到固定不動的微生物。
二、樣品處理
1。沉積物樣品用沉積物細胞固定液，按照體積比例，以1：5（樣品1份，固定液5份）的比例稀釋和固定樣品，用渦旋儀（Vortex）混勻；4度儲存20 min，然後取100 μl固定樣品，裝入2 ml離心管進行細胞提取 （可以多做幾個平行樣品）；
2。在超淨臺中，向100 μl的稀釋樣品中加入500 μl醋酸緩衝液 （pH = 4。6），蓋上管蓋，放在室溫下反應兩小時，每半小時開一次管蓋，以排出CO
2
；
3。3，000 × g離心10 min，離心結束後，將上清轉移到乾淨的2 ml離心管中，收集待測；
4。上述步驟離心後的沉澱即為除碳酸鹽後的沉積物，向該沉澱中加入400 μl 含有3。5%（w/v）NaCl的PBS溶液，重新懸浮沉澱，並加入50 μl的去汙劑混合液和50 μl的甲醇；
5。用注射器在樣品懸液底部分別依次緩慢加入500 μl 30%、50% 和80%（w/v） Nycodenz溶液（影片）；
6。3，000 × g離心10 min，從最表面吸取液體，將上清轉移至乾淨的離心管內，收集待測；
注：不要跟第3步的上清液放在一個管內，否則EDTA會和Ca離子螯合，產生沉澱。
7。棄去管內剩下的Nycodenz溶液，用400 μl 3。5%NaCl的PBS溶液將管內沉澱重懸，並加入去汙劑混合液和甲醇各50 μl；
8。將2mL離心管置於冰水混合物上，超聲波探頭插入冰水下3 cm並距離離心管5 cm，15 W超聲，每次10 s，間隔20 s，一共5次（超聲波探頭放置位置見影片）；
9。重複第5-6兩步 （加Nycodenz，離心，取上清），將上清液裝入無菌離心管中，收集待測；
10。將上述獲得的三部分上清液過濾到0。22 μm濾膜上。先用無菌水潤洗漏斗兩次，墊上濾膜襯墊紙，用無菌水潤溼，開泵將紙墊吸附在漏斗上，加入5 ml 3。5% NaCl的1XPBS溶液，靜置2~3 min檢測是否漏液。如果不漏液的話，再加入上清攪勻後再開啟真空泵抽濾，使液體全部過濾完，以保證所有細胞在膜上分佈均勻。若漏液，重新組裝各部分並再次檢驗是否漏液。
11。在超淨臺內，將濾膜放置在無菌培養皿上，用移液器吸取100 μl 100 X SYBR Green I染液均勻滴加在濾膜上，避光染色30 min後，用無菌濾紙，放在濾膜邊緣吸乾多餘的染液；
12。加入40 μl 50%的甘油作為防淬滅劑和折光介質覆蓋在濾膜上，壓上蓋玻片，除去氣泡，用配置有FITC通道或等效通道的熒光顯微鏡檢測。
13。開啟FITC熒光顯微鏡，將載玻片放在顯微鏡的載物臺上固定， 10倍鏡粗調焦距，40倍鏡下細調焦距，在明場下觀察濾膜至能清晰分辨濾膜表面的紋理，表明此時焦平面已調節至濾膜表面附近，找到目標視野，在蓋玻片上滴少量鏡油，再放入載物臺上，轉換成油鏡，並且切換顯微鏡至熒光觀察模式，選擇熒光通道GFP或等效濾光塊。樣品中微生物細胞應呈明亮綠色熒光，且形態符合一般生物外形。沉積物中部分雜質也會吸附熒光分子並呈現類似熒光訊號，可以轉換熒光訊號到Tex red熒光通道，如果顆粒仍舊有紅光，有可能是沉積物顆粒，而非細胞，應小心分辨。
14。細胞計數，對於每個濾膜，隨機挑選16個目鏡視野，拍照後統計視野中微生物總數a。每個樣品應有數個平行組過濾在相應數量b的濾膜上。為使結果可信，應滿足 > 1000 （個）。
15。估算每張濾膜上的微生物總數 c = 。其中，m為視野面積，a為該濾膜上16個視野中微生物總數，d為漏斗接觸濾膜處內徑。估算原始樣品中微生物數量x =，其中，V為計算得到的過濾至單一濾膜上的原始樣品體積，b為平行組數量。
16。觀察並拍照，儲存合適的圖片用於細胞計數。
17。觀察和拍照結束後，關閉所有光源，用二甲苯擦拭油鏡物鏡端鏡頭，將載物臺調整至原始位置，換鏡轉盤轉換到空鏡頭位。
溶液配方
1。 沉積物細胞固定液（4%（w/v）多聚甲醛溶液）
在通風櫥內稱取 4 g多聚甲醛，0。1 g氫氧化鈉，以及2 g氯化鈉，加入90 mL 1X PBS緩衝液中，放入磁力攪拌子，在磁力攪拌器上溶解。待白色顆粒完全溶解後，使用1 M 鹽酸溶液調節pH為7。0左右並補充1X PBS至100 mL，並使用0。22 m無菌的針式過濾器將該溶液收集於無菌玻璃瓶內，保存於4℃，現配現用。
2。 1 X磷酸鹽緩衝液（phosphate buffer saline，PBS）
取100 mL 10×磷酸鹽緩衝液（pH = 7。4），稀釋於800 mL蒸餾水中，補充去離子水至1000 mL，121℃高壓滅菌2 0 min，冷卻至室溫待用。
3。 含有3 。5% NaCl的PBS溶液
稱取3。5 g NaCl，加入到100 mL去1 X PBS溶液中，121℃高壓滅菌2 0 min，冷卻至室溫待用。
4。醋酸緩衝液（pH = 4。6）
量取2 ml乙酸，稱取3。5 g 醋酸鈉和3。3 g NaCl，加入8 0 mL去離子水，再加入5 ml 40%甲醛溶液混合均勻，定容至100 ml，用稀鹽酸調節溶液pH = 4。6，用0。22 m無菌濾膜過濾至無菌的玻璃瓶中，室溫儲存。
5。去汙劑混合液
量取0。5 M 乙二胺四乙酸鈉溶液（Ethylene Diamine Tetra acetic Acid，EDTA，pH 8。0）2 mL，稱取焦磷酸鈉 0。266 g加入到EDTA中，再取0。1 mL 吐溫-80（Tween 80）加入到溶液中，補充去離子水至10 mL。用0。22 m無菌針式過濾器過濾至無菌的玻璃瓶中，避光室溫儲存。
6。梯度密度Nycodenz溶液
稱取30 g，50 g和80 g Nycodenz粉末，分別加入到80 mL去離子水中，並定容至100 mL，配製成質量體積分數為30%、50%和80%（w/v）的Nycodenz 水溶液。然後使用無菌的針式過濾器過濾滅菌，並收集在避光的無菌離心管中，4 ℃儲存。
7。 100 X SYBR Green I染液
避光環境下，在超淨臺中用移液器吸取10 μl SYBR Green I 10，000×原液，加入到裝有990 μL無菌去離子水的2 mL離心管中，離心管外壁包上鋁箔避光，在vortex上混勻1 min，4 儲存。
8。 50%甘油保護液
量取50 ml甘油，加入50 ml無菌去離子水，用0。2μm無菌濾膜過濾，儲存至無菌的玻璃瓶中，室溫儲存。
致謝
本實驗方案摘自Jens Kallmeyer發表的文章New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments： Cell extraction of deep subsurface sediments。
參考文獻
1。Kallmeyer， J。， et al。 （2008）。
New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments: Cell extraction of deep subsurface sediments
.
Limnology and Oceanography： Methods 6： 236-245。
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