靶向治療誘導的肺癌進化：單細胞轉錄組分析
原創 李虹 CellPress細胞科學 來自專輯Cell Press青促會述評
生命科學
Life science
作為世界領先的全科學領域學術出版社，細胞出版社特與“中國科學院青年創新促進會”合作開設“青促會述評”專欄，以期增進學術互動，促進國際交流。
第二十期專欄文章，由中國科學院上海營養與健康研究所研究員、中國科學院青年創新促進會會員 李虹，就Cell中的論文發表述評。
肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤，遠端轉移是導致肺癌死亡的主要原因。以往的研究關注基因組變異對肺癌發生和發展的影響，發現了EGFR， ALK， ROS1和BRAF等高頻變異的癌基因，為靶向治療提供了可能，延長了部分患者的生存時間。然而靶向治療可能伴隨著皮疹、腹瀉、出血、肝損傷等副作用，並且患者常常由於獲得性耐藥而復發。為了改善靶向治療的療效，急需瞭解治療後腫瘤和微環境的進化過程和異質性。
單細胞轉錄組測序是研究複雜生物系統異質性的有效方法。2018年Bernard Thienpont帶領的研究團隊透過對正常與癌變樣本近10萬個單細胞的研究，建立了第一個完整的肺癌細胞圖譜，包括52個不同亞類的基質細胞，說明了肺癌微環境遠比我們想象的複雜（Lambrechts， D， 2018）。由於獲得高質量的晚期肺癌的樣本非常困難，對晚期肺癌的單細胞研究還很少。2020年5月Hae-Ock Lee和Myung-Ju Ahn的團隊對44個肺癌病人原發灶、胸膜液、淋巴結或腦轉移的腫瘤樣本進行單細胞測序，發現了一種與肺癌轉移密切相關的癌細胞亞型，基質細胞和免疫細胞創造了促腫瘤和免疫抑制的微環境，增強了我們對轉移性肺癌分子和細胞動力學的理解（Kim， N，2020）。
Cell（《細胞》）8月20日上線了來自加州大學的Trever G。 Bivona、Collin M。 Blakely和Chan Zuckerberg Biohub研究中心的Spyros Darmanis團隊合作發表的題為“Therapy-Induced Evolution of Human Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing”的文章。透過對轉移性肺癌患者靶向治療前後的單細胞測序研究，揭示了癌細胞的分子多樣性、治療誘導的免疫微環境可塑性，該研究結果有助於改善肺癌治療的臨床療效。
作者收集了來自30位患者的組織樣本。經質控保留下來的樣本包含15個未接受靶向治療的樣本（TN）、14個對靶向治療有響應的樣本（RD）以及20個獲得性耐藥的樣本（PD）。總共採集到23261個單細胞（圖1）。
▲圖1 樣本採集以及實驗整體設計思路
分析樣本中攜帶的基因突變發現，單細胞測序資料可以鑑定到新的突變（圖2）。例如，在經過多線治療的樣本LTS47中，新鑑定到KRAS基因上發生G13D以及G12C的突變。而先前經bulk DNA測序發現該患者攜帶的EML4-ALK的基因重組變異並沒有出現在這些KRAS突變的細胞中。值得注意的，腫瘤驅動突變的丟失是一種可能的耐藥機制（Lovly et al。， 2017； Xu et al。， 2018a）。這或許可用於解析LTS47樣本上突變變化。
▲圖2 單細胞RNA測序資料鑑定出新的突變位點
在轉錄組上，RD樣本較TN樣本上調了參與細胞損傷修復過程的基因，包括二型肺泡（alveolar type 2， AT2）相關基因以及WNT/β-catenin訊號通路關鍵蛋白（CTNNB1）和下游靶標（SUSD2）。AT2細胞參與肺部損傷修復（Wang et al。， 2018），而WNT/β-catenin訊號通路是調控該過程的關鍵訊號通路 （Huch et al。， 2013； Tammela et al。，2017）。TCGA的肺腺癌患者的資料顯示高表達肺泡基因訊號的患者有更好的生存。另外，透過早期聯合用藥同時抑制WNT/β-catenin訊號通路以及EGFR（或ALK）能提高藥物響應的程度。
PD較TN顯著上調參與kynurenine通路的基因。TCGA的肺腺癌資料顯示高表達kynurenine通路的患者生存較差。PD較RD高表達了浸潤（invasion）、細胞間交流以及免疫調控相關的基因，其中包括參與血纖維蛋白溶酶原通路的基因（ANXA2， PLAT， PLAUR， PLAU和SERPINE1）。而高表達該訊號通路基因的TCGA肺腺癌患者有較差的生存（圖3）。另外，透過對比來自同一個患者的TN-RD-PD三配對樣本。作者發現PD中高表達鱗狀細胞分化相關的基因（KRT16， KRT14， KRT6A， KRT5等），說明PD樣本表現出部分鱗癌特徵。組織病理學上由肺腺癌向鱗癌的轉化也是一種可能的耐藥機制。
▲圖3 RD以及PD樣本的單細胞表達譜特徵
最後作者系統地研究了腫瘤浸潤的免疫細胞。在8種鑑定到的免疫細胞中，T細胞及macrophage是浸潤丰度最高的兩類細胞。有意思的是，作者發現T細胞在RD樣本中比例升高（27% TN， 46% RD， 31% PD），而macrophage則是在RD中比例降低（37% TN， 21% RD， 37% PD）。另外，它們在RD及PD中浸潤的細胞亞型有很大不同。RD中浸潤著較多的細胞毒性的T細胞，而PD主要浸潤的是 IDO1陽性的macrophage以及免疫抑制作用的T細胞（如：Treg細胞）（圖4）。
▲圖4 不同階段樣本中腫瘤免疫浸潤情況
總結全文，作者利用單細胞測序技術系統地研究了靶向治療前（TN），藥物響應（RD）以及獲得性耐藥（PD）三個不同階段的非小細胞肺癌樣本，解析了不同階段腫瘤細胞的特徵以及腫瘤浸潤免疫細胞的組成。這對我們理解轉移性NSCLC的腫瘤微環境組成以及它們在耐藥構成中的複雜變化提供了新的認知（圖五）。同時，基於這些特徵，作者提供了新的用藥思路，如：早期聯合抑制EGFR（或ALK）和WNT/β-catenin訊號通路等，這對臨床用藥有極大的提示意義。
▲圖5 不同狀態下非小細胞肺癌的腫瘤生態系統
本文參考文獻
1。Lambrechts， D。， Wauters， E。， Boeckx， B。 et al。 Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment。 Nat Med 24， 1277–1289 （2018）。
Kim， N。， Kim， H。K。， Lee， K。 et al。 Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma。 Nat Commun 11， 2285 （2020）。
2。Lovly， C。M。， Iyengar， P。， and Gainor， J。F。 Managing Resistance to EFGR- and ALK-Targeted Therapies。 Am。 Soc。 Clin。 Oncol。 Educ。 Book 37， 607–618 （2017）。
Xu， J。， Zhao， X。， He， D。 et al。 Loss of EGFR confers acquired resistance to AZD9291 in an EGFR-mutant non-small cell lung cancer cell line with an epithelial-mesenchymal transition phenotype。 J。 Cancer Res。 Clin。 Oncol。 144， 1413–1422 （2018a）。
3。Huch， M。， Bonfanti， P。， Boj， S。F。 et al。 Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/Rspondin axis。 EMBO J。 32， 2708–2721 （2013）。
4。Tammela， T。， Sanchez-Rivera， F。J。， Cetinbas， N。M。 et al。 A Wntproducing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma。 Nature 545， 355–359 （2017）。
5。Wang， Y。， Tang， Z。， Huang， H。 et al。 Pulmonary alveolar type I cell population consists of two distinct subtypes that differ in cell fate。 Proc。 Natl。 Acad。 Sci。 USA 115， 2407–2412 （2018）。
論文摘要
肺癌是導致癌症死亡的主要原因，肺癌的異質性使癌細胞有適應能力，降低了治療成功率，而對這背後的機制仍不完全清楚。本文對30個轉移性肺癌病人治療前和靶向治療過程中的49個樣本進行單細胞轉錄組測序，獲得了2萬多個癌症和腫瘤微環境的單細胞圖譜，呈現了豐富和動態的腫瘤生態系統。癌細胞的單細胞測序發現了常規臨床檢測未探測到的可靶向的癌基因。靶向治療後殘留的癌細胞（RD）表達肺泡再生訊號，可能是治療引起的細胞狀態轉變；治療中進展的癌細胞（PD）則上調犬尿氨酸、纖溶酶原和縫隙連線通路。RD中T淋巴細胞啟用、巨噬細胞減少；而PD則處於免疫抑制狀態。這項研究闡明瞭轉移性肺癌治療誘導的多細胞生態系統的適應性對臨床療效的影響。
Lung cancer， the leading cause of cancer mortality， exhibits heterogeneity that enables adaptability， limits therapeutic success， and remains incompletely understood。 Single-cell RNA sequencing （scRNA-seq） of metastatic lung cancer was performed using 49 clinical biopsies obtained from 30 patients before and during targeted therapy。 Over 20，000 cancer and tumor microenvironment （TME） single-cell profiles exposed a rich and dynamic tumor ecosystem。 scRNA-seq of cancer cells illuminated targetable oncogenes beyond those detected clinically。 Cancer cells surviving therapy as residual disease （RD） expressed an alveolar-regenerative cell signature suggesting a therapy-induced primitive cell-state transition， whereas those present at ontherapy progressive disease （PD） upregulated kynurenine， plasminogen， and gap-junction pathways。 Active T-lymphocytes and decreased macrophages were present at RD and immunosuppressive cell states characterized PD。 Biological features revealed by scRNA-seq were biomarkers of clinical outcomes in independent cohorts。 This study highlights how therapy-induced adaptation of the multi-cellular ecosystem of metastatic cancer shapes clinical outcomes。
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述評人簡介
李虹
中國科學院青促會會員
中國科學院上海營養與健康研究所研究員
李虹，博士，中國科學院上海營養與健康研究所研究員，2018年入選中國科學院青年創新促進會會員，主要從事腫瘤系統生物學和組學大資料整合研究。在Cancer Cell， Cell Stem Cell， Genome Medicine， Nucleic Acids Research， PloS Genetics 等期刊發表研究論文50餘篇，論文被引用2，000餘次。獲得上海市楊帆計劃、中國科學院優秀青年人才專案、中國自然科學基金青年專案和麵上專案資助。
Hong Li is a professor in Shanghai Institute of Nutrition and Health， Chinese Academy of Sciences （CAS）。 She was selected as a member （2018） of Youth Innovation Promotion Association of CAS。 Her research mainly focuses on cancer system biology and the integrative studies of omics big data。 She published more than 50 research articles in SCI journals， including Cancer Cell， Cell Stem Cell， Genome Medicine， Nucleic Acids Research and PloS Genetics， which were cited over 2，000 times。 She received foundation support from Knowledge Innovation Program of CAS， Science and Technology Commission of Shanghai Municipality， and National Natural Science Foundation of China。
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原文刊載於CellPress細胞出版社旗下期刊 Cell 上，
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