巢式PCR一般適用於一些有必要增加靈敏度或特異性的PCR反應

基因組DNA被酶消化產生攜帶已知基因（及其他）的DNA片段，並透過Southern印跡雜交測定。這些DNA片段透過連線環化，然後從已知序列中設計反向延伸的特異引物來擴增已知序列間的未知序列。

擴增產物是一條線性DNA片段，其中包含有最初用於消化DNA的限制性酶切位點。這個位點是以前克隆的已知序列與其側翼未知序列的交界。擴增片段大小依賴於已知序列和側翼區域中限制性酶切位點的分佈。

用不同限制性酶切位點得到的DNA為模板，透過反向PCR可獲得4kb大小的DNA側翼序列（Jones and Winistorfer 1993 ）。

無論已知序列的上游還是下游側翼區，只通過一個已知序列內不存在的限制性酶切位點的切割反應，進行一次反向PCR就能獲得。以下方案由Dennis McKearin提供（University of Texas Southwestern Medical Center，Dallas）。

巢式PCR一般適用於一些有必要增加靈敏度和/或特異性的PCR反應，例如，擴增一個特定的多型基因家族成員，或者擴增-種mRNA丰度極低的臨床標本的cDNA副本，並且這個標本含有幾種不同的細胞型別（混合細胞群體）。

巢式PCR通常涉及兩個連續的擴增反應，每個反應使用一對不同的引物（Smit et al。1988； Kemp et al。1989）。第一次擴增反應的產物被用作第二次PCR的模板，而第二次反應的寡核苷酸引物對位於第一對引物內側 （圖7-3）。