血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

電泳為什麼要光澤面

一、實驗目的

ü 瞭解電泳技術的一般原理

ü 學習醋酸纖維薄膜電泳的操作

二、實驗原理

Ø 電泳是指帶電質點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現象。在一定pH條件下，不同的質點由於具有不同的等電點而帶不同性質的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此可使它們分離

Ø 影響電泳遷移率的外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現象

Ø 影響電泳遷移率的內在因素：質點所帶淨電荷的量、質點的大小和形狀

Ø 按支援介質不同可將電泳分為紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳

Ø 另外，還可以按分離原理不同、支援介質形狀不同、用途不同以及所用電壓不同等將電泳分類

Ø 電泳的裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產生電場，驅動帶電分子的遷移；電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類

Ø 採用醋酸纖維薄膜作為支援物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙醯化所形成的纖維素醋酸酯，將它溶於有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）後，塗抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，厚度約為120μm，有很強的通透性，對分子移動阻力很小

Ø 醋酸纖維素薄膜電泳是近年來推廣的一種新技術，它具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現象等優點

Ø 本實驗以醋酸纖維素為電泳支援物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質由於氨基酸組成、分子量、等電點及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支援物，正常人血清在pH8。6的緩衝體系中電泳，染色後可顯示5條區帶。其中清蛋白的泳動速度最快，其餘依次為α1-、α2-、β-及γ-球蛋白

三、實驗器材

醋酸纖維薄膜（2×8 cm），常壓電泳儀，點樣器（蓋玻片），培養皿，粗濾，載玻片，鑷子

四、實驗材料與試劑

兔血清（實驗室製備），巴比妥緩衝液（pH8。6，離子強度0。07），

染色液（氨基黑10B），漂洗液

五、實驗操作

Ø 浸泡：將2×8 cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。在無光澤面距短邊一端1。5 cm處用鉛筆輕輕畫一條點樣線，將之置於盛有緩衝液的平皿中，浸泡30 min方可用於點樣

Ø 點樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內吸乾多餘的緩衝液，然後平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一 載玻片上滴一滴血清，點樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動一次），再將點樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內，形成均勻的直線

Ø 電泳槽的準備：根據電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電泳緩衝液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電泳緩衝液中。當濾紙全部潤溼後，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋

Ø 電泳：將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10 min。通電，調節電壓至160 V，電流強度為0。4～0。6 mA/cm膜寬度，電泳時間約25 min

Ø 染色：電泳完畢後將薄膜取下， 放在含氨基黑10B染色液的培養皿中浸泡5 min

Ø 漂洗：將薄膜從染色液中取出後移置漂洗液中漂洗數次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜

六、注意事項

Ø 市售醋酸纖維素薄膜均為幹膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。若飄浮於液麵的薄膜在15～30 s內迅速潤溼，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用於電泳

Ø 醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8。6巴比妥－巴比妥鈉緩衝液，其濃度為0。05～0。09 mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關。緩衝液濃度過低，則區帶泳動速度快區帶擴散變寬；緩衝液濃度過高，則區帶泳動速度慢，區帶分佈過於集中，不易分辨

Ø 點樣時，應將薄膜表面多餘的緩衝液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散。但不宜太乾，否則樣品不易進入膜內，造成點樣起始點參差不起，影響分離效果

Ø 點樣時，動作要輕、穩，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區帶分離效果

Ø 電泳時應選擇合適的電流強度，一般電流強度為0。4～0。6mA/cm膜寬度。電流強度高，則熱效應高；電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散

Ø 操作過程為防止指紋汙染，應戴手套

七、實驗思考

Ø 用醋酸纖維薄膜電泳做電泳支援物有什麼優點？

Ø 電泳圖譜清晰的關鍵是什麼？如何正確操作？