不同CHO細胞系在抗體表達與生物量合成之間的抉擇

生物量什麼意思

1

背景介紹

中國倉鼠卵巢細胞CHO已開發出了CHO-DXB11，CHO-K1， CHO-DG44， 和CHO-S等不同譜系的細胞系。儘管所有的細胞系都出自一個祖先，但是廣泛的基因突變，克隆篩選使得它們之間已有了大量的異質性。測序資料顯示它們有著不同的基因缺失和突變，同時也有了不同的生物程序。鮮有文章報道由於CHO細胞系基因差異造成的生物程序的不同。本文以人工染色體BAC為載體，探究了3種最常用細胞系CHO-K1，CHO-S， 和CHO-DG44在表達基因工程抗體方面的差異。透過分批培養，分批補料培養，半連續灌注培養的方式研究了細胞特異性增殖以及產物形成情況。除此之外，本文還研究了兩種不同培養基對抗體表達量和糖基化的影響。我們發現，CHO細胞特異性合成抗體的能力屬於不同細胞系的專有屬性，宿主細胞和培養基共同決定了抗體的產量和質量。

CHO-DXB11，CHO-K1， CHO-DG44， 和CHO-S始於同一個祖先，CHO由Dr。Theodore Puck於1956年分離得到，CHO-K1作為CHO的亞克隆株誕生於1957年，1980年，CHO-DXB11由CHO-K1透過基因突變而得到，1983年Urlaub等人透過基因突變刪除了DHFR雙等位基因得到了CHO-DG44，1991年由CHO派生出了CHO-S，截至目前，以上四種細胞系都已用於商業化醫藥生產。

圖1。CHO細胞系突變概覽

圖片來自Nat。Biotechnol。 2013， 31， 759。

2

結果與分析

2.1

製備重組抗體表達細胞池及細胞適應性培養

如補充圖1A、B所示初次BAC轉染的CHO-K1，CHO-S， 和CHO-DG443種細胞系，對應的細胞池分泌抗體的能力分別為5。04±2。37pg/Cell/Day（CHO-K1）， 3。29±1。82 pg/Cell/Day（CHO-S）， 1。10 ±0。73pg/Cell/Day（CHO-DG44） ，細胞轉染，篩選，亞克隆都在CDCHO培養基中完成，細胞適應性培養在ActiCHOTMP （GE Healthcare） 培養基中進行。流式細胞術檢測三種細胞系構建的重組細胞株都有很好的適應性，細胞密度都能很好的達到CDCHO培養基培養的密度，甚至更高，且幾乎沒有抗體表達丟失的細胞。

補充圖

1.

三種細胞系由

CDCHO

培養基到

ActiCHO

TM

P

培養基的適應過程。

2.2

分批培養評估

3

種細胞系的生產效能

如圖1所示分批培養期間與CHO-S，和CHO-DG44相比CHO-K1在ActiCHOTMP培養基中表現出了4-6倍的細胞密度和抗體表達量增長，因此在批次培養期間CHO-K1顯示出最佳的抗體生產效能，CHO-S最差，細胞存活時間和細胞密度與細胞抗體產量關係分析顯示CHO-S表現出了最快的增殖速度，CHO-K1表現出了最好的抗體表達量。

2.3

批次補料培養評估

3

種細胞系的生產效能

在ActiCHOTMP培養基批次補料培養條件下CHO-S依然表現出了最佳的增殖速度，抗體表達方面CHO-DG44最佳達到了670mg 。L-1，CHO-K1次之，達到了460mg。L-1，CHO-S370 mg 。L-1。有趣的是在CDCHO培養基分批補料培養條件下CHO-K1產量為350mg。L-1，CHO-S為175mg。L-1，而CHO-DG44僅為115mg。L-1。以上實驗結果表明新增營養液濃縮物顯著影響著那些對所新增物騙號的宿主細胞的累計。但是無論如何CHO-K1保持了抗體的高水平表達，CHO-DG44，CHO-S次之。

對比分批培養，ActiCHOTMP培養基中CHO-K1細胞密度有個近乎2倍的峰值，但抗體的產量僅高出10%-20%，其原因歸咎於抗體產生率的顯著降低。補料分批培養沒有影響CHO-S的細胞密度峰值，但是隨著持續培養到第6天，可行的累積培養天數的延長几乎使得抗體濃度增加了6倍，在CDCHO細胞培養基中，分批補料培養CHO-S細胞其可行性細胞累積天數不及在ActiCHOTMP培養基中，因此在分批補料培養過程中，抗體表達增加僅2。5倍。對於CHO-DG44來說，分批補料培養使得細胞密度也有個近乎2倍的峰值，細胞可行性累積時間和特異性細胞抗體產生率也有提高，抗體總表達量提高了近乎5倍，但是CDCHO補料分批培養並沒有改善細胞的密度和抗體表達能力。

2.4

連續灌注培養評估

3

種細胞系的生產效能

半連續灌注培養過程中，每天換液一次，CHO-S細胞表現出最快的增殖速度，最先達到細胞密度峰值，CHO-K1以最低的細胞密度25x106 c ml-1到達穩定期，這一值與CHO-DG44在CDCHO培養基中的值類似。有趣的是CHO-DG44在ActiCHOTMP培養基中細胞持續性增值，細胞密度達到了CHO在各種培養條件下的最大值，這一結果證明了每天換液保證了CHO不同譜系細胞各自的營養需求，從而極大影響著細胞的增殖。每隔24h換液一次CHO-K1表現出最高的抗體表達量，CHO-DG44，CHO-S次之。在兩種培養基中CHO-K1都表現出了最高的抗體生產率13-16pg/Cell/Day，遠超CHO-DG444-5pg/Cell/Day，CHO-S2pg/Cell/Day。

圖1。總細胞密度和可行性累計培養時間對應三種細胞系CHO-K1，CHO-DG44，CHO-S在三種培養條件，批次，補料批次，灌注培養，兩種培養基CDCHO，ActiCHOTM培養條件下抗體表達情況。

2.5mRNA

評估

高水平抗體生產率是否意味著高水平的輕重鏈mRNA，透過對補料分批培養細胞幾天後，對抗體重鏈輕鏈mRNA定量分析，發現三種CHO細胞系，隨著培養時間的累積，細胞特異性抗體生產率逐漸降低，重鏈，輕鏈mRNA也存在著相應的差異。因此我們統計了培養第4天產物特異性mRNA和細胞特異性抗體生產力qP值，所有的細胞克隆處於相同的細胞密度水平，都處於指數生長期。有趣的是CHO-K1細胞裡抗體重鏈輕鏈mRNA水平與補料息息相關，相應的這種補料也影響著特異性抗體表達量。但是統計資料顯示mRNA水平無法準確預測抗體表達量。

圖2.平均水平(A)重鏈mRNA,(B)輕鏈mRNA,(C)灌注培養過程中三種細胞系在兩種培養基裡第4,7及終止培養時抗體產率。

2.6CHO

細胞系和抗體生產質量

培養過程中不同CHO細胞系表現出的差異提醒我們不得不去考量所產抗體的質量。我們決定首先從補料分批培養開始研究，因為目前多數生產工藝都採取補料分批培養的策略，我們推測，由於補料批次的產品積累，即使是微小的細胞系，特別是與產品相關的差異可能比其他工藝模式更明顯。

總體上來說三種細胞系表達抗體的Fc段巖藻糖糖基化主要有G0F，G1F， 和G2F三種形式，類似於自然狀態下人血清中IgG的形式。研究表明細胞系和培養基影響著某些形式的糖相對丰度。比如當培養基從ActiCHOTMP轉換為CDCHO培養基時，CHO-K1和CHO-S細胞中抗體半乳糖基化含量從17%提升到37%，而CHO-DG44中半乳糖糖基化抗體含量不變。表達的單抗上G0F（無乳糖醯化糖）的丰度在CHO-S組高於CHO-K1和CHO-DG44。產物甘露糖糖基化，巖藻糖糖基化，無乳糖糖基化幾乎是不同CHO細胞的專有屬性，培養基對其影響不大。CHO-S組表達產物甘露糖糖基化水平在2%-3%，而CHO-K1和CHO-DG44產物甘露糖糖基化水平分別為5%-9%，11%-13%。產物巖藻糖糖基化在CHO-S細胞裡高達94%-96%，在CHO-K1和CHO-DG44分別為82%–84%和71%–83%。無乳糖糖型在CHO-K1細胞產物裡佔2%-5%，CHO-S細胞裡佔1%，CHO-DG44細胞產物裡未見其形式的糖。

圖

3.

三種細胞系在兩種培養基裡灌注培養條件下抗體重鏈糖型分佈

除了Fc上的糖基化位點，本文還發現了表達抗體在輕鏈上還存在著一個糖基化位點。該糖基化位點糖型主要以巖藻糖為核心的糖複合物，以G0F，G1F，G2F形式為主，偶爾有唾液酸殘基。抗體輕鏈甘露糖糖基化在CHO-S產物中≤1。5%，在CHO-K1中為4%–6%，CHO-DG44為5%-13%。產物輕鏈巖藻糖糖基化在CHO-S約為46%，CHODG44細胞中為（76–88%），CHO-K1細胞中為83%–90%。唾液酸化抗體在CHO-K1中佔21%-36%，CHO-DG44中為15%-19%，CHO-S中為6%-15%，儘管可檢測的不同糖型變化在幾種細胞間是微妙的，但是其對藥物藥效的影響需要具體問題具體分析。

圖

4.

三種細胞系在兩種培養基裡灌注培養條件下抗體輕鏈糖型分佈

哺乳動物蛋白翻譯後修飾有助於蛋白正確摺疊，穩定，以及功能發揮。為了探究不同細胞系所產同種抗體的構像穩定性，對蛋白質熱穩定性進行研究。DSC測量發現四種過渡態蛋白未摺疊形式，非常重要的是，培養基對抗體穩定性並沒有影響。CHO-S表達抗體解鏈溫度TM1為64。3±0。2℃，明顯低於CHO-K1和CHO-DG44表達抗體的解鏈溫度TM166±0。3℃ 1。7℃。進一步對錶達抗體質譜分析發現，CHO-S表達抗體的輕鏈丟失了C末端的絲氨酸Ser。

圖5。三種細胞系在兩種培養基裡灌注培養條件下抗體熱穩定性分析

3

討論

時至今日幾乎70%的生物製品都來自於CHO細胞重組表達。大量文獻鮮有對不同宿主細胞系進行類比。不同公司根據自己的需求選擇細胞系來生產自己所需要的產品，這一點無可厚非。為了更好地闡述選擇的合理性，我們對三種細胞系在兩種培養基，三種培養方式下抗體表達情況做了研究，研究發現，宿主細胞的生理性偏好有利於生物質合成和抗體的表達。

3.1CHO

宿主細胞到底偏好於抗體生產還是生物量合成?

為了客觀地類比三種細胞系表達抗體的情況，三種細胞系最終轉染表達同一種抗體的質粒，根據生產實踐挑選最好的適用於生產的細胞系。在細胞系製備篩選過程中，CHO-K1都變現出了它優秀的效能。適應性培養基提供了細胞增殖，蛋白表達，遺傳物質穩定等眾多條件，三種細胞系在適應性培養基直接培養成功獲得了生產用細胞株。細胞增殖，細胞密度在ActiCHOTMP培養基中，無論分批，補料分批，灌流培養條件下都顯著高於CDCHO培養基在各種培養條件。這就表明培養基中營養物質的平衡影響著細胞株的效能。培養基獨立實驗中發現CHO-S顯示出更高的增殖速率，高於CHO-K1，CHO-DG4410%-50%，這屬於細胞株固有的生長偏好特性，在未轉染的CHO-S分批培養楊條件下也顯示出比CHO-K1，CHO-DG44增殖速度快的特點。

高抗體滴度和相對較低的生物量累積預示著CHO-K1有最好的抗體表達量。而CHO-S剛好相反，抗體表達量最低。CHO-DG44抗體表達量處於CHO-K1和CHO-S中間水平。這一趨勢在兩種培養基，三種培養條件下都是一致的。對抗體輕重鏈mRNA定量分析發現，不同的CHO細胞系裡，儘管兩種mRNA來自於同一個cDNABAC，但其複製數有差別，LC只有1-2個複製，HC有3-4個複製。當然，這很有可能是基礎對數計算的結果。我們的資料顯示，在整個過程中，與產品相關的mRNA與細胞特異性單克隆抗體的生產率之間沒有統計學上顯著的相關性，因為這兩個引數都隨著三個CHO細胞系的培養時間而變化。考慮到這些衍生的CHO細胞系經歷過廣泛的基因突變和克隆選擇，我們推測決定抗體表達差異的關鍵與細胞表型和代謝有關，與特異性mRNA的差別，以及基因插入位點，細胞培養基無關。基因共表達網路（GCN）和轉錄量與蛋白質表達水平長期以來已有多數文章報道，但是他們之間的關係仍然存在著爭議。

CHO細胞系產物合成率的差異可能要歸咎於不同細胞系不等同的翻譯效率及其處理加工的容量。比如最新發現的CHO-K1細胞比起CHO-DUXB11細胞有更大的內質網，更豐富的線粒體以及與之對應的高細胞特異性抗體表達量。內質網對於分泌蛋白的摺疊組裝非常關鍵，如果一個內質網裡不可逆錯誤摺疊的蛋白超過一定限度，細胞將啟動未摺疊蛋白響應機制，最終發生細胞凋亡。因此大內質網有利於分泌蛋白的高產率也有利於高產細胞的存活和蛋白加工。豐富的線粒體基質有利於細胞自我供能便於內質網加工處理未摺疊的蛋白。由於內質網和線粒體佔據了細胞內大量的空間，因此抗體表達量也反映在細胞體積大小上，我們發現灌流培養時高產的CHO-K1細胞直徑15。7μm±0。7 ，CHO-DG44直徑14。2μm±0。5 ，CHO-S直徑13。7μm±1。1。

3.2CHO

宿主細胞與抗體糖基化修飾

糖基化修飾在很大程度上決定了抗體的有效性和安全性。改變Fc段糖基化修飾將影響到Fc段的構象，受體結合，以及免疫功能效應。

我們的研究顯示，抗體的糖基化主要與宿主細胞有關，較高丰度甘露糖糖基化，較低丰度巖藻糖糖基化抗體表達宿主細胞依次為CHO-DG44，CHO-K1，CHO-S。高甘露糖，低巖藻糖抗體一般有較強的ADCC效應。半乳糖糖基化可以增加抗體的功能效應，半乳糖糖基化僅受培養基的影響。然而在使用的培養基中半乳糖並沒有被量化，一般情況下CHO-K1有較高的半乳糖糖基化抗體。只有抗體的輕鏈糖基化含有唾液酸殘基，很大程度上決定了抗體立體易接近性。唾液酸化作用也有助於延長抗體的半衰期和抗炎症效應。唾液酸化抗體在CHO-K1表達的抗體中較高，CHO-DG44，CHO-S次之。宿主細胞特異性糖基化模式可能與宿主基因異質性異質性有關，不同的宿主細胞可能表達不同的糖基化基因。

Lewis

等人的研究發現倉鼠屬有256種糖基化酶相關基因，13種非同義SNPs，2種插入或缺失移碼，25%的複製數變異CNVs，CHO-DG44，CHO-K1，CHO-S至少存在一種以上情形。雖然不是所有的SNPs對產物糖基化和宿主基質偏好影響都能被檢測到，但是糖基化是個漫長，分支進行的過程，這就增加了由於基因突變改變最終糖基化形式的可能。我們的結果也應證了這一假設，不同的CHO表達系統含有不同的糖基化模式，這樣就可以根據需求選擇不同的宿主生產需要的產物。

哺乳動物細胞蛋白生產過程中的翻譯後修飾是蛋白質正確摺疊，穩定，發揮功能的關鍵。蛋白質熱穩定性有助於提高蛋白產量，我們的研究表明CHO-S表達蛋白熱穩定性相對最差，蛋白表達量也最低，儘管蛋白表達量上CHO-DG44抗體表達量比CHO-S細胞高不太多，但蛋白穩定性確跟CHO-K1表達蛋白接近。抗體CHO-S表達抗體熔解溫度Tm1相比CHO-K1，CHO-DG44表達抗體低出來的1。7℃是否影響抗體表達量還很難確認。抗體熱穩定性差可能的原因是CHO-S表達抗體輕鏈C端ser的缺失。這一原因是否是直接導致CHO細胞系表達抗體熱穩定性差還不得而知。Shen等人的研究表明刪除λ輕鏈C端Ser有助於提高抗體的熱穩定性和PH依賴的穩定性，而且刪除Ser並沒有影響抗體與抗原的結合。但當IgG1λ輕鏈的Ser存在時，熱穩定性會變得更高。培養基對抗體熱穩定性沒有影響。

4

結論

隨著高通量測序的發展，大量測序資料顯示，不同CHO細胞系存在著遺傳物質異質性。有關遺傳物質差異造成的細胞表型差異顯而易見，但是在生物合成抗體表達方面具體會產生什麼影響報道的並不多，本文闡述了細胞表型決定了CHO細胞特異性偏好表達抗體和生物合成過程。CHO-K1代謝偏好於抗體形成，CHO-S代謝偏好於生物量形成，CHO-DG44介於之間。這種偏好獨立與培養模式和培養基。因此生產過程中細胞系的選擇對產物有根本性的影響。當下CHO細胞系基因組和表型差異還不太清楚，目前還未成為宿主選擇考慮的物件。CHO序列特異性知識與特異性培養方法的結合，將為未來構建細胞系工程方法和細胞系後續工藝，以及生物過程和細胞培養基的改進提供有力的工具。本研究發現基因背景影響著宿主細胞的表型，最終影響著產物的產量和糖基化修飾等質量。因此正確的選擇宿主細胞才能達到生產所需求產物的目的。

原文來源

：

Reinhart D， Damjanovic L， Kaisermayer C，et，al。 Bioprocessing of Recombinant CHO-K1， CHO-DG44， and CHO-S： CHO Expression Hosts FavorEither mAb Production or Biomass Synthesis。Biotechnol J。 2019 Mar；14（3）：e1700686。