腫瘤耐藥
1概述
影響化療效果的一個重要問題是發生了對細胞毒藥物的耐藥性。耐藥性的產生機制，尤其是多藥耐藥性問題是目前研究的一個重點。
根據腫瘤細胞的耐藥特點，耐藥可分為原藥耐藥（PDR）和（MDR）兩大類，原藥耐藥（PDR）是指對一種抗腫瘤藥物產生抗藥性後，對非同型別藥物仍敏感；多藥耐藥性（multiple drug resistance，MDR）是指一些癌細胞對一種抗腫瘤藥物產生耐藥性，同時對其他非同類藥物也產生抗藥性，是造成腫瘤化學藥物治療（化療）失敗的主要原因。
多藥耐藥可進一步分為內在性多藥耐藥（intrinsicMDR，也有譯成天然性多藥耐藥）和獲得性多藥耐藥（acquired MDR）。內在性多藥耐藥（intrinsicMDR）的腫瘤，一開始對抗腫瘤藥物就具有抗藥性。包括消化器官、呼吸系統、泌尿系統以及中樞神經系統腫瘤引起的約佔61%；屬獲得性多藥耐藥（acquired MDR）的腫瘤，包括面板癌、乳腺癌、生殖器癌、內分泌腫瘤、白血病和淋巴瘤，約佔33%。
許多天然來源的抗腫瘤藥物如生物鹼類抗癌藥物（秋水仙鹼、長春鹼、三尖杉酯鹼和酯杉醇等），蒽環類抗癌抗生素（阿黴素和柔紅黴素），表鬼臼毒素類（Vp-16和VM-26）及合成藥（米託蒽醌和胺苯丫啶）都極易發生MDR。新發現的藥物如紫杉醇和治療慢性粒性白血病的STI-571，都是剛用於臨床就發現有耐藥性，這使問題更加嚴重。
2耐藥發生的機制
2。1 DNA修復能力的增強與耐藥的關係
DNA是傳統的化療藥品烷化劑和鉑類化合物的作用靶點，這些藥物的細胞毒性與DNA損傷有關。DNA損傷的一個修復機制是切除修復，切除修復需核酸內切酶、DNA聚合酶、DNA連線酶等的參與。化療藥致使DNA損傷，當二氫葉酸還原酶（DHFR）和DNA損傷修復相關酶活性增強（MGMT）可增加其對化療藥的耐藥程度。
阿非迪黴素（aphidicolin）是DNA多聚酶α和γ亞基的抑制劑
2。2 P-糖蛋白與多藥耐藥
目前研究最多的是多藥耐藥，與多藥耐藥有關的分子是P-糖蛋白。1976年，Juliano等首先在耐藥有中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中發現一種分子量約為1。7×105的膜糖蛋白，在敏感細胞中卻不存在。以後，研究者陸續在不同來源的多藥耐藥細胞中發現這種糖蛋白，其分子量在1。3×105~1。8×105之間，主要集中在1。5×105~1。8×105之間。並發現該糖蛋的表達和細胞膜的通透性、細胞內藥物濃度以及細胞耐藥程度有關。定位於7號染色體的q21。1帶上的MDR1基因。完整的P-gp分子共有12個跨膜疏水區和2個ATP結合位點，在膜內以二聚體或四聚體方式存在。P糖蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，也就是說它可以與一些抗腫瘤藥物結合，也有ATP結合位點。P-糖蛋白一旦與抗腫瘤藥物結合，透過ATP提供能量，就可將藥物從細胞內泵出細胞外，使藥物在細胞內濃度不斷下降，並使其細胞毒作用減弱直至散失，出現耐藥現象。P-gp在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血幹細胞等均有表達，負責激素運輸及排泌毒物等生理功能。P-gp高表達的腫瘤病人常伴預後不良，如低緩解率、高複發率、生存期短，可作為預後評價指標。
鈣拮抗劑（或鈣調蛋白拮抗劑）如維拉帕米、異博定、尼卡地平可使耐藥細胞部分恢復對化療藥物的敏感性，其中以維拉帕米的作用最明顯。維拉帕米對耐藥細胞的作用不是透過調節鈣濃度，而是與抗癌藥物競爭P-糖蛋白的結合位點。但是鈣拮抗劑在逆轉耐藥的劑量下還具有一些副作用，使這類藥物臨床應用受到限制。
鈣調蛋白（CAM）抑制劑：改變膜電位，使耐藥細胞膜電位恢復至敏感細胞水平，從而恢復其敏感性。如鈣調蛋白拮抗劑三氟拉嗪的作用。
親脂性化合物：環孢菌素類（環孢菌素A及其衍生物SDZPSC833）。
激素及抗激素類化合物：（TAM）及抗孕激素藥RU486 ，孕酮、甲地孕酮。
2。3 谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）與腫瘤耐藥性
GSTs是一種廣泛分佈的二聚酶，它可以單獨或與谷胱甘肽一起參與許多環境毒素的代謝、解毒。根據其在細胞內定位的不同，一般可分為α、μ、π、θ及膜結合微粒體5種類型 。GST-π又稱酸性同工酶，是從胎盤中分離出來的一種酸性GST，其基因定位於11號染色體的q13位置。有7個外顯子和6個內含子，全長3kb。它與惡性腫瘤關係最密切，約佔其總數的90%，主要分佈於消化道、泌尿系統和呼吸道上皮。GSH是一種含半胱氨酸的三肽，為細胞內主要的非蛋白巰基。GSTs能夠催化機體內親電性化合物與GSH結合，使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出細胞外。這種結合還可防止有毒化合物與細胞的大分子物質（如DNA、RNA和蛋白質）結合。正常情況下可作為一種保護機制使細胞免受損害，而腫瘤細胞可以透過調節GSH水平、增加GST活性等加速化學藥物的代謝。
針對谷胱甘肽和GST的逆轉劑：目前抑制GSH的藥物有丁硫氨酸亞碸胺（buthionine sulfoximine ，BSO）、硝基咪唑類、VitK3、撲熱息痛、硒酸鈉、硒半胱氨酸、GS-EA等。BSO是一種人工合成的氨基酸，它是GSH合成限速酶-γ谷氨醯-半胱氨酸合成酶的強效抑制劑，能有效地阻斷GSH的合成，從而降低細胞內GSH水平，並增加腫瘤細胞對Mit、DDP和MMC的敏感性。利尿酸，其可逆轉烷化劑的耐藥，且有實驗證實與BSO聯用時逆轉作用更大。此外，還有依他尼酸（ethacrynic acid）等。
2。4 拓撲異構酶Ⅱ
拓撲異構酶是DNA複製時必需的酶，它在染色體解旋時催化DNA斷裂和重新連線，拓撲異構酶是許多DNA插入和非插入藥物作用的靶點，拓撲異構酶Ⅱ在數量和功能上的改變可能是產生細胞耐藥的機制。
2。5 蛋白激酶C（PKC）
PKC是一組Ca2+/磷脂依賴的同工酶，由兩個不同的功能部位組成，即與磷脂、甘油二酯結合的疏水性調節部位，以及含有ATP的底物蛋白結合區域，後者是親水性催化部位。PKC有12種類型，各亞型具有不同的組織表達和特定的細胞定位，其中，PKCα和PKCθ與腫瘤多藥耐藥的關係最為密切。PKC在機體細胞增值、分化和凋亡訊號傳導調控方面發揮重要作用，同時在腫瘤發生、發展及對抗瘤因子的反應方面也扮演著重要角色。PKC參與蛋白質的磷酸化過程，而p-gp是一種磷酸化蛋白，MDR細胞中PKC活性增高，說明兩者存在一定的聯絡。
根據作用於PKC的部位，其抑制劑可分為3類：①作用於催化區；②作用於調節區；③對以上兩區均有作用。目前已證實的逆轉劑有Staurosporine及其衍生物NA-382、CGP41251；此外還有K-252a、calphostinC、H-7等藥物。
2。6 多藥耐藥相關蛋白MRP
MRP屬ABC轉運蛋白超家族成員，MRP基因定位於16號染色體p13。1帶上，由6500bp組成，編碼1531個氨基酸的跨膜糖蛋白，分子量為190kD。耐藥的發生與依賴ATP的谷胱甘肽S結合載體（glutathione-S-conjugate carrier）活性提高的緣故，谷胱甘肽S結合的輸出載體又稱為“GS-X泵”，它可將陰離子的共軛物排洩出細胞，並在清除外源性毒素中發揮作用。MRP能介導藥物中的谷胱甘肽硫共軛物、葡萄糖醛酸甙共軛物和硫酸鹽共軛物排出細胞。MRP轉運的步驟可能為：GSH合成→GSH與藥物偶和→MRP將藥物泵出細胞外。MRP不但定位於血漿細胞膜，而且存在於內質網、高爾基濾泡處，提示MRP還可在細胞內隔離藥物，使藥物不能與靶位點結合，從而間接導致耐藥。
喹啉類、抗激素類（如抗孕激素RU486）、非甾體抗炎藥（NASID）、SN-38、GST耗竭劑都能逆轉MRP介導的MDR。
2。7 肺耐藥蛋白（LRP）
是1993年由Scheper等在1株無p-gp表達的對多種藥物耐藥的非小細胞細胞系SW-1573中最先發現的與多藥耐藥有關的蛋白稱LRP。LRP基因定位於16號染色體，LRP的cDNA全長2688bp，編碼896個氨基酸，分子量為110kD，主要位於胞漿，呈粗顆粒狀或囊泡狀。MVP可透過兩種途徑引起MDR：一是封鎖核孔，使藥物不能進入細胞核，二是使進入細胞內的藥物轉運至胞質中的運輸囊泡，呈房室分佈，最終經胞吐機制排出。
2。8 乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）
BCRP定位於染色體4q22，含有一個開放讀框（ORF），編碼一個633氨基酸的蛋白，至少與50個ATP結合盒（adenosine triphosphate -binding cassette，ABC）膜轉運蛋白具有同源性。BCRP結構的最主要特點是隻有一個ATP結合結構域和一個疏水性的跨膜結構域，這與典型的ABC轉運蛋白明顯不同，後者往往由兩個同源部分組成，每個部分含有一個ATP結合結構域和一個疏水性的跨膜結構域。因此，稱BCRP為半轉運蛋白，推測可能本身或與其它轉運分子形成二聚體或多聚體而發揮作用。
2。9 細胞凋亡與耐藥
p53、bcl-2和c-myc發生缺失、突變等導致表達異常（突變型）時，對凋亡過程調控異常，可抑制化療藥物誘導的凋亡，導致耐藥，同時也可特異性啟用MRP-1/P-gp，產生MDR。c-myc基因很可能參與了mdr1基因的調控。半胱氨酸蛋白水解酶和耐藥：天門冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶家族即caspase家族，亦稱ICE/CED-3家族，是一組與細胞凋亡有關的蛋白酶，也參與MDR。Topo I和Topo II可作為caspase 3和6作用底物。化療藥物引起細胞凋亡均須啟用caspase。
加入促凋亡物質如全反式維甲酸等可降低耐藥細胞BCL-2、BCL-XL等基因的表達。植入促凋亡基因，如野生型p-53基因等。
2。10 其它
細胞膜的改變影響藥物的轉運和外排；細胞激素受體量和親和力的改變；一些細胞因子（如IL-6 ［42］）等也與腫瘤細胞耐藥的發生相關。
3利用生物技術逆轉耐藥
3。1 給藥載體介導系統在耐藥逆轉中的應用
逆轉劑的應用無疑是解決MDR的一種常用方法，但往往因為逆轉劑的毒性較強，副作用較大而影響其在臨床上的廣泛引用。因此，藉助某些給藥介導載體，減少藥物用量，實現藥物的靶向給藥將是頗有意義的新途徑。包括：①多肽、蛋白類介導載體；②脂質體（liposome）介導；③豪微粒（nanoparticles，NP）介導。
3。2 反義寡核苷酸技術（ASONs）
就是用一段人工合成的能與RNA或DNA互補結合的寡核苷酸鏈來抑制基因的表達，其作用原理是：①ASONs與DNA結合，抑制DNA複製和轉錄；②ASONs與mRNA前體結合，阻斷RNA加工、成熟，影響核糖體沿mRNA移動；③啟用RNase剪下雜交鏈中未配對的鹼基。最近有學者［57］用MRP和bcl-2反義寡核苷酸共轉染耐順鉑肺腺癌細胞株（A549/DDP），使該細胞對順鉑敏感性增加4。8-7。2倍。同時對VP-16和表阿黴素敏感性也同步增加。雜合子丟失（Loss of heterozygosity，LOH）可引起必需基因的單核苷酸多型性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs），抑瘤基因P53附近的核糖核酸聚合酶II（POLR2A）基因經常在腫瘤細胞顯示雜合性丟失。Kees Fluiter等的報道顯示，直接作用於POLR2A的反義寡核苷酸能抑制體內腫瘤細胞生長，並且一個鹼基的錯配就能有效地抑制腫瘤生長的特定等位基因。
3。3 反義RNA技術
反義RNA技術指利用基因重組技術，構建人工表達載體，使其體外或體內表達反義RNA，從而抑制靶基因的表達。其作用原理有：①與前mRNA結合，影響mRNA的成熟和在胞漿內轉運；②與相應的靶RNA結合從而啟用RNase，加速靶RNA的降解；③直接與起始密碼子AUG結合而阻止轉錄的啟動；④互補作用於SD編碼區的反義RNA可阻止核糖體在mRNA上的移動。Gao等分別把攜有MDR1、MRP反義RNA的逆轉錄病毒匯入阿黴素選擇出的人NSCLC細胞株GAOK，細胞對阿黴素、長春花鹼、秋水仙鹼的耐藥程度減少40%-50%，而共轉染MDR1和MRP反義RNA後發現，p-gp、MRP的表達分別減少64%和93%，對上述化療耐藥程度減少97%左右。實驗提示p-gp、MRP在GAOK細胞株耐藥過程中共同起作用，共轉染兩者的反義RNA可協同逆轉耐藥。
3。4 核酶技術
核酶是一類具有酶活性的RNA分子，由Cech等首次發現，它能特異性地識別mRNA中的GUC序列，並催化RNA的剪接和剪下反應，這種作用無需能量就能使RNA被降解，使之無法進行轉錄和翻譯，而且催化效率很高，一分子核酶可切割多分子的靶RNA，自身不被消耗可重複使用。核酶的基因組成分兩部分：中間的極為保守的核苷酸序列（活性中心）和兩端的引導序列。引導序列與靶RNA互補結合時，中間保守序列即在該特定位點切斷，從而具有高度特異性。另外，核酶不編碼蛋白質，無免疫原性。由於其高效率、高特異性、少副作用的特點，核酶在基因治療中倍受青睞，被譽為“分子剪刀”和“分子外科”，在抗HIV、抗病毒和治療白血病及腫瘤方面得到了廣泛的應用。Chen等用mdr1核酶匯入A549/R對mdr1 mRNA進行剪下，觀察到mdr1 mRNA減少，p-gp表達下降，細胞對阿黴素敏感性增加200倍。GAO 等用逆轉錄病毒介導的MDR1核酶來抑制p-gp在耐藥的腫瘤細胞系GAOK/DOX的表達。Kobayashi用MDR1核酶來逆轉急性淋巴細胞白血病細胞的耐藥性，結果藥物敏感性增加了700倍。值得指出的是，逆轉錄病毒由於其可產生高效價病毒，具有高感染效率，可感染許多種細胞，且對宿主細胞無害而在基因逆轉方面具有潛在優勢。目前，反義核酸藥物的開發也是最有前景的專案之一，但事實上仍有許多問題待解決：①寡聚物易被降解（經過化學修飾的類似物也可在體內緩慢清除）；②細胞攝取的效率有待提高；③寡聚物的非特異結合降低了其效率；④對mRNA的非特異阻斷（可能由於寡聚物同DNA序列能形成部分或暫時的鹼基配對）。
3。6 細胞因子基因
Stein等研究發現一些細胞因子如TNF、IFN和IL-2可降低MDR1基因mRNA和p-gp的表達水平，增加細胞對藥物的敏感性。但細胞因子靜脈應用副作用極大，因此他們將細胞因子基因轉入腫瘤細胞，結果顯示可明顯降低MDR1 mRNA 和p-gp的表達水平，使細胞內藥物濃度提高。AKI等［65］在研究細胞系（HepG2，HuH7，SK-Hep-1）時發現，IFN-α和順鉑（CDDP）聯用時，可降低MDR1、MRP、TOPO IIα和TOPO IIβ基因在HepG2中的表達；降低MDR1和GST-π基因在SK-Hep-1中的表達，從而可增加耐藥細胞系對順鉑（CDDP）的敏感性。這提示我們，聯合應用CDDP和IFN-α來治療進展期可能具有一定的臨床價值。
3。7 間接對抗MDR的基因治療
將一些耐藥基因（如MDR1、MRP等）轉移至造血幹細胞［66］，以降低化療藥物對骨髓的毒性，這樣就可能用高劑量的藥物殺傷腫瘤細胞而不破壞骨髓細胞，間接解決耐藥的問題。體外實驗表明，將MDR1基因轉移至小鼠的正常骨髓細胞，可提高化療劑量而不增加骨髓毒性［67，68］。根據前臨床研究結果，荷蘭學者提出將MDR1基因轉移至大計量化療後無法治癒的腫瘤患者的造血幹細胞開展臨床I期的研究。透過臨床I期研究主要想解決幾個問題：①MDR1基因轉移至骨髓造血細胞後是否可使CD34+細胞MDR表達增加；②回輸轉染MDR1的細胞後是否可使造血重建；③是否具有長期重建造血的功能；④對於化療引起的骨髓抑制是否具有保護作用。如果I期臨床試驗能獲得令人滿意的結果，這個方案將進入II期試驗，即加大化療計量，觀察對骨髓的保護效應。除MDR基因外，二氫葉酸還原酶（mDHFR）、MGMT、GST及醛脫氫酶（ALDH）等也被用於腫瘤耐藥基因的研究。
